高 雷 張 帆 孫 麗 李 娜 崔海港

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-12(glucose transporter-12,GLUT12)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT家族的一員[1],主要分布于脂肪和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)，負(fù)責(zé)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。腫瘤組織新陳代謝率高，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求高。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞對葡萄糖有著更高的需求[3]。癌細(xì)胞通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖以滿足細(xì)胞營養(yǎng)需求，研究結(jié)果似乎能解釋GLUT12蛋白特異性地表達(dá)于乳腺癌、前列腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的現(xiàn)象[4-5]。

目前僅有關(guān)于GLUT12在結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)細(xì)胞株HT29中報(bào)道[5]，其在CRC組織中的表達(dá)和功能尚不清楚。槲皮素(quercetin,QC)是廣泛存在于植物中的一種黃酮類化學(xué)成分，對多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膽囊癌等均有抑制作用[6]。QC能抑制小腸上皮葡萄糖共轉(zhuǎn)蛋白SGLT1[7]，對GLUT12等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用卻不清楚。為探討能否將GLUT12作為治療CRC的靶點(diǎn)，本文研究了 GLUT12在CRC細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況, 在此基礎(chǔ)上考察了聯(lián)合使用QC和奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)對CRC細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人結(jié)腸癌DLD-1、HCT-15以及SW620細(xì)胞均購自于南京凱基生物有限公司。HIEC-6正常人腸上皮細(xì)胞購自于上海江林生物科技有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 OXA(美國Sigma-Aldrich公司，09512)；QC(上海純優(yōu)生物科技有限公司, 117-39-5)；MTT及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma-Aldrich公司，D2650)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，11012-8611)。DMEM高糖配方培養(yǎng)基(美國Sigma-Aldrich公司, D5546)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(江蘇碧云生物技術(shù)研究公司, P0010)。0.5%醋酸結(jié)晶紫溶液(實(shí)驗(yàn)室自配)；抗體GLUT12及β-actin(美國Abcam公司, 批號分別為ab75441和ab8226)；其他抗體(二抗)購自于Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA, 批號分別為sc-516132，sc-516192)。EZ-10 DNAaway (上海生工公司, B618133)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Bio-Rad公司)；NUAIRE生物安全柜(美國Nuaire公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；NIKON Eclipse熒光顯微鏡(日本NIKON公司)；Spectra Max M2 多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Chemi doc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Mini-PROTEAN Tetra轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；T100型pcr基因擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)；低溫冰箱(美國Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌DLD-1、HCT-15和SW620以及正常人腸上皮HIEC-6細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，種植密度為每瓶約1×106細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于含DMEM的高糖培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，青霉素-鏈霉素1×105U/L，2.0 g NaHCO3)培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3～5 d換培養(yǎng)液，并仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長狀況。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 腫瘤組織的采集、存放及處理 采集20例CRC患者的腫瘤組織，試驗(yàn)經(jīng)由倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者實(shí)驗(yàn)前均簽訂知情同意書?；颊吣挲g50～70歲，未經(jīng)過放化療，未有長期服用其他藥物的歷史，肝腎功能等指標(biāo)也處于正常范圍。采集的腫瘤組織全部經(jīng)過病理技師確認(rèn)。采集的腫瘤或者周圍的正常組織大小為2～3 cm，組織采集后立即用冰生理鹽水沖洗，冷凍并存放于液氮中。免疫組化前，所有樣本解凍并經(jīng)專業(yè)的病理技師進(jìn)行石蠟包埋處理。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測 GLUT12基因表達(dá) 按1.2.1中所述條件傳代培養(yǎng)人結(jié)腸癌DLD-1、HCT-15、SW620及正常人腸壁HIEC-6細(xì)胞。細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用EZ-10 DNAaway試劑盒提取細(xì)胞總RNA。用NANOdrop測量RNA含量及純度。根據(jù)EZ-10 DNAaway試劑盒說明書，A260/A280>1.8被認(rèn)為是合格樣品。將總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板單鏈cDNA。以cDNA為模板，對合成的cDNA進(jìn)行PCR，PCR條件設(shè)定為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，75 ℃ 30 s，循環(huán)進(jìn)行35次。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)海藻糖凝膠電泳分離，紫外條件下可視化處理并拍照記錄產(chǎn)物條帶，使用IMAGE J 軟件 (美國)分析條帶的強(qiáng)弱，以各種癌細(xì)胞株中GLUT12表達(dá)強(qiáng)度值和正常HIEC-6細(xì)胞中GLUT12表達(dá)強(qiáng)度值的比值表示GLUT12 PCR產(chǎn)物在該細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)弱。

1.2.4 免疫組化法檢測腫瘤組織中GLUT12蛋白表達(dá) 將含有腸癌組織的石蠟切片在二甲苯和不同濃度的乙醇水溶液中進(jìn)行脫蠟和脫水處理。然后，將切片置于含有3%的H2O2的溶液中，室溫孵育30 min后，在高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)水洗3次，每次10 min。GLUT12一抗(Abcam: ab75441)4 ℃ 過夜孵育，PBS水洗3次，每次10 min。添加辣根氧化酶標(biāo)記的二抗(Santa Cruz: sc516132)室溫孵育2 h后，PBS水洗5次，每次5 min。滴加二氨基聯(lián)苯于組織切片上，顯色反應(yīng)須控制在1 min之內(nèi)完成。然后水洗玻片10 min，蘇木精復(fù)染5 min，乙醇梯度脫水，透化，封片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢。采用盲法對染色的切片進(jìn)行打分[8]，0分為染色陰性，1分為染色較弱，2分為中等強(qiáng)度表達(dá)，3分為較強(qiáng)表達(dá)，4分為最強(qiáng)表達(dá)。

1.2.5 免疫熒光法檢測細(xì)胞GLUT12蛋白表達(dá) 將人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞種植于含有圓形蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。2～3 d后，細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，用不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基孵育4 h，分別加入5、10 mM葡萄糖作為處理組，加入10 mM葡萄糖+5 mM QC作為共同培養(yǎng)組，對照組只加培養(yǎng)基。共同孵育6 h后，吸掉舊培養(yǎng)基，加入冰冷的PBS溶液終止反應(yīng)。每孔細(xì)胞用冷的4%的多聚甲醛固定15 min后，用含有0.2%的Triton X-100透化。透化后，每孔細(xì)胞加入Image-iTTMFX熒光信號增強(qiáng)劑(美國Life Tech)。用含有3%羊血清及2%牛血白蛋白的封閉劑封閉1 h，細(xì)胞與GLUT12一抗(Abcam: ab75441)孵育1 h，再與紅色熒光素標(biāo)記的二抗(Santa Cruz: sc-516192 )孵育2 h。清洗殘余抗體后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上，用含有熒光保護(hù)劑和細(xì)胞核染色劑Vectashield封閉。倒置熒光顯微鏡下，檢查細(xì)胞熒光強(qiáng)度并拍照。ECL顯影后，用GELDOC2000凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

1.2.6 蛋白印記法檢測GLUT12蛋白含量變化 用含有不同濃度葡萄糖(5、20、100 Mm)或抑制劑(10 mM)的培養(yǎng)基孵育人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞6 h后，選用提取蛋白試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，再用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量試劑盒進(jìn)行定量。選用適合濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后選用硝酸纖維膜轉(zhuǎn)移蛋白，再用5%的脫脂奶粉室溫封閉4 h，含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution with tween-20, PBST) 洗3次，每次10 min，GLUT12一抗(Abcam: ab75441)在4 ℃冰箱孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Santa Cruz: sc516132)稀釋液室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min?？梢暬幚聿⑴恼沼涗浤z中產(chǎn)物條帶, 使用IMAGE J 軟件 (美國)分析條帶的強(qiáng)弱，以各種癌細(xì)胞株中GLUT12表達(dá)強(qiáng)度值和正常HIEC-6細(xì)胞中GLUT12表達(dá)強(qiáng)度值的比值表示GLUT12在該細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)弱。

1.2.7 MTT比色法檢測細(xì)胞活力 胰酶消化生長旺盛的DLD-1和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，稀釋成5×107/L的細(xì)胞懸液。用排槍接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)藥物處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞過夜貼壁后，用排槍吸棄舊的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)向培養(yǎng)孔中添加含有不同濃度OXA或者GLUT12抑制劑的培養(yǎng)液200 μL。實(shí)驗(yàn)分別分為空白組，槲皮素組 (Q, 濃度為 5 mM)， OXL組 (OXA，濃度為10 μM),和OXL與槲皮素聯(lián)合組 (OXL+Q：OXA濃度為10 μM, 槲皮素濃度為 5 mM)，空白組只添加相同體積的培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育2 h后，用排槍輕輕地吸取培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO用以溶解紫色結(jié)晶，持續(xù)震蕩15 min后，使用酶標(biāo)儀在490 nm條件下測量各孔的吸光度。對照組加入不含藥物的等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(藥物處理組吸光度/對照組吸光度)× 100%。

1.2.8 腫瘤細(xì)胞集落生成實(shí)驗(yàn)(colony forming assay,CFA) 將結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板中，每孔600細(xì)胞。24 h后，每孔細(xì)胞加入含有各種濃度藥物的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分別分為空白組、槲皮素組(Q,濃度為 5 mM)、OXL組 (OXA，濃度為5μM)和OXL與槲皮素聯(lián)合組 (OXL+Q：OXA濃度為5 μM, 槲皮素濃度為5 mM)，空白組只添加相同體積的培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)14 d。期間單個(gè)細(xì)胞會分化成由多個(gè)細(xì)胞所組成的細(xì)胞集落。培養(yǎng)結(jié)束每孔細(xì)胞用2 mL溫?zé)岬腜BS輕柔潤洗后，加入2 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液，輕柔震蕩5 min，用PBS輕輕漂洗3次后，細(xì)胞集落會被染成藍(lán)色的顆粒狀可見物。人工清點(diǎn)細(xì)胞組成>50的細(xì)胞集落數(shù)目。使用Image J軟件中的粒子直徑分析功能計(jì)算各個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞群落的平均直徑(軟件默認(rèn)為任意單位)。

2 結(jié)果

2.1 GLUT12基因在CRC中的表達(dá) GLUT12基因在3種癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，在DLD-1細(xì)胞株中的表達(dá)含量最高，為(3.5±0.7)，在SW620、HCT-15細(xì)胞株中的相對含量分別為(3.1±0.2)和(2.6±0.4)。另外，與DLD-1、 SW620和HCT-15癌細(xì)胞相比，正常腸上皮細(xì)胞HIEC-6中的GLUT12含量最低(相對表達(dá)值為1，P< 0.05)。 見圖1。

A

B

A B

注：A為核酸在凝膠中的條帶圖；B為GLUT12基因相對于HIEC-6表達(dá)值，與HIEC-6比較，*P<0.05

2.2 GLUT12蛋白在CRC中的表達(dá) GLUT12在腫瘤組織和正常組織中均有不同程度的表達(dá)，GLUT12在腫瘤組織中的表達(dá)水平為(3.2±0.3)，正常組織的表達(dá)水平為(0.5±0.6),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 GLUT12在腫瘤及正常組織中的表達(dá)(免疫組化法，×400)

2.3 GLUT12蛋白在CRC細(xì)胞中的表達(dá)定位與水平的變化 在含有少量葡萄糖的培養(yǎng)基中GLUT12在細(xì)胞中僅有少量的表達(dá)，主要集中于細(xì)胞核周圍。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖含量的升高，GLUT12含量升高，主要集中分布于細(xì)胞膜周圍。當(dāng)DLD-1細(xì)胞與GLUT12抑制劑一起培養(yǎng)時(shí)，高糖條件并不能提高該蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，也不能改變其在細(xì)胞中的定位。見圖3。

免疫印跡法也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在含低濃度葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí) (5 mM)，GLUT12的表達(dá)含量很低(97.3±6.8)%。升高培養(yǎng)基中的葡萄糖含量(20,100 mM)，該蛋白表達(dá)亦顯著性地升高，分別為(123.2±5.7)% 與(193.4±5.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)細(xì)胞和GUT12抑制劑QC一起孵育時(shí)，即使升高培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，GLUT12的表達(dá)水平也未出現(xiàn)顯著變化。見圖4。

2.3 GLUT12抑制劑對OXA殺傷腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用 MTT試驗(yàn)顯示， DLD-1 細(xì)胞和QC一起孵育后，其活力和空白處理組相比并沒有顯著變化[Q:(94.7±4.3) %vs空白：(95.8±5.4)%]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OXA和細(xì)胞一起孵育能顯著地降低細(xì)胞活力[OXL:(89.4±4.2)%vs空白：(95.7±5.2)%，P< 0.05]。當(dāng)OXA處理的DLD-1細(xì)胞培養(yǎng)液中聯(lián)合加入QC時(shí)，細(xì)胞的活力降至更低的水平[OXL+ Q:(63.3±7.1)%vsOXL:(89.7±4.2)%,P<0.05]。然而，對于SW620細(xì)胞來說，QC并不能產(chǎn)生類似的藥效協(xié)同作用。見圖5。

接下來的CFA實(shí)驗(yàn)考察了癌細(xì)胞群落的數(shù)量和粒徑。QC單用并不會對癌細(xì)胞群落的數(shù)量產(chǎn)生明顯的影響[QC:(362.3±23.7)vs空白：(353.2±13.4),P>0.05]。OXA和細(xì)胞孵育并沒有明顯地減少細(xì)胞群落的數(shù)量[OXL:(347.6±17.2)vs空白：(352.7±13.4),P>0.05]。從形成的癌細(xì)胞群落的粒徑來說，QC單用亦不會對癌細(xì)胞群落的粒徑產(chǎn)生明顯地影響[QC:(716.8±15.2)vs空白：(591.7±33.4),P>0.05]。OXA和細(xì)胞孵育卻能明顯地減少細(xì)胞群落的粒徑 [OXL:(125.1±12.4)vs空白：(591.7±32.6),P< 0.05]。當(dāng)QC和OXA聯(lián)用幾乎能殺死所有癌細(xì)胞群落。見圖6。

圖3 熒光顯微鏡下GLUT12蛋白在不同條件下的變化(×400)

注：A表示對照組；B表示5 mM葡萄糖處理組；C表示10 mM葡萄糖處理組；D表示10 mM葡萄糖+5 mM QC共同培養(yǎng)組

圖4 蛋白印跡法檢測不同條件下GLUT12的變化

注：A為GLUT12蛋白條帶圖；B為相應(yīng)條帶的密度測定柱狀圖，與低糖組(5 mM)相比，*P<0.05

圖5 MTT法檢測QC與OXA的協(xié)同作用

注：Q為QC組(濃度為5 mM)；OXL+Q為QC與OXA聯(lián)用組與空白組相比，*P<0.05

圖6 腫瘤集落生成法檢測QC與OXA的協(xié)同作用(n=3)

注：A為不同藥物孵育條件下腫瘤細(xì)胞的集落生成情況，使用0.5%結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞群落進(jìn)行染色；B為相應(yīng)的關(guān)于腫瘤集落大小比較，Q為QC組(濃度為5 mM)，OXL+Q為QC與OXA聯(lián)用組

3 討論

本研究證實(shí)GLUT12在CRC細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá)。體外功能驗(yàn)證試驗(yàn)也提示該蛋白在CRC的發(fā)展中起到一定的促進(jìn)作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)說明該蛋白有可能成為聯(lián)合用藥方面的治療性靶點(diǎn)。

RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)GLUT12基因在CRC細(xì)胞中異常升高，免疫組化的結(jié)果證實(shí)其蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)和正常組織比也是升高。目前關(guān)于GLUT12在CRC中的報(bào)道較少，Pujolgimenez等[5]發(fā)現(xiàn)GLUT12基因在CRC細(xì)胞HT29中的表達(dá)是上調(diào)的。本研究選用更多類型的CRC細(xì)胞株作為研究對象。為了對比該研究也觀察了該基因在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HIEC-6中的表達(dá)水平，綜合Pujolgimenez等的實(shí)驗(yàn)以及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以推測CRC腫瘤細(xì)胞需要較多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來維持對葡萄糖的營養(yǎng)需求[9-10]。Pujolgimenez等[5]發(fā)現(xiàn)GLUT12在乳腺癌與前列腺癌中的表達(dá)是異常升高，與本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)一致。

細(xì)胞免疫化學(xué)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，GLUT12蛋白在高糖環(huán)境下會上調(diào)表達(dá)濃度，表明GLUT12在體內(nèi)腫瘤組織中有可能是通過提高自身表達(dá)水平來滿足營養(yǎng)需求。在靜息狀態(tài)下，GLUT12主要分布于細(xì)胞核周圍，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入胰島素時(shí)，GLUT12會轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜周圍，為轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖做好準(zhǔn)備[11]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，QC能阻斷高糖引起的該蛋白表達(dá)的上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究的發(fā)現(xiàn)與關(guān)于QC抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的報(bào)道一致[12]。

MTT及CFA細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QC與OXA合用會起到很好的協(xié)同作用，而在另一種CRC細(xì)胞株SW620上沒有觀察到類似的協(xié)同作用。鑒于DLD-1中的GLUT12含量比SW620高很多(見上述基因表達(dá)結(jié)果)，檢測QC和OXA協(xié)同作用取決于GLUT12的基礎(chǔ)表達(dá)含量的高低。另外，這種結(jié)果的差異也可能是由于這兩種細(xì)胞來源的不同造成，如DLD-1細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，而SW620細(xì)胞則是來源于人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶[13]。

CRC細(xì)胞中有多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體存在[9]，如GLUT1和GLUT4等，本研究雖然證實(shí)CRC細(xì)胞或組織中的GLUT12確有表達(dá)，卻未進(jìn)一步考察這些葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體相互協(xié)作的具體作用機(jī)制。此外本次研究也未深入分析GLUT12是否還參于到糖酵解等代謝通路或者P53等信號通路，如條件允許還可圍繞GLUT12開展更多機(jī)制性的研究。本文對GLUT12在CRC中表達(dá)和功能做了初步研究，在體外評價(jià)了GLUT12抑制劑QC和常用抗癌藥物OXA聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證GLUT12作為CRC治療性靶點(diǎn)的可能提供了研究基礎(chǔ)。