劉立山，郎 俠，王彩蓮，周 瑞，宋淑珍，宮旭胤，王 斐，吳建平

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

人工授精技術(shù)在提高奶牛繁殖力及奶牛生產(chǎn)性能中發(fā)揮著重要作用［1］。在當(dāng)今奶牛養(yǎng)殖的實(shí)際生產(chǎn)中，由于發(fā)情鑒定技術(shù)的限制以及部分母牛產(chǎn)后卵巢和子宮出現(xiàn)病變，長(zhǎng)時(shí)間無(wú)發(fā)情表現(xiàn)［2］，嚴(yán)重影響了奶牛卵巢和子宮的復(fù)舊，降低了牛群繁殖率［3-5］。而同期發(fā)情技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)難孕母牛以及繁殖有障礙的母牛集中發(fā)情和配種，達(dá)到正常受孕和產(chǎn)犢。定時(shí)輸精可以使牛的發(fā)情時(shí)間集中，防止隱性發(fā)情造成的漏配現(xiàn)象，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度［6］。因此，同期發(fā)情定時(shí)輸精技術(shù)是提高養(yǎng)殖場(chǎng)母牛繁殖效率以及經(jīng)濟(jì)效益的重要保證。但是由于奶牛體況的差異，在進(jìn)行外源激素處理時(shí)的效應(yīng)也有差異［7-9］。

本試驗(yàn)使用不同劑量的PGF2α和GnRH通過(guò)同期發(fā)情定時(shí)輸精程序，對(duì)荷斯坦奶牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，探討不同劑量的PGF2α和GnRH對(duì)奶牛同期發(fā)情效果的影響，為人工調(diào)控產(chǎn)后母牛的生殖機(jī)能障礙性疾病和提高奶牛受胎率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年9月在甘肅省臨洮縣華加牧業(yè)科技有限責(zé)任公司進(jìn)行。選擇荷斯坦經(jīng)產(chǎn)牛15頭，嚴(yán)格按照牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.1 試驗(yàn)試劑 PGF2α為PGF2α類似物氯前列醇鈉注射液，蘇州市蘇牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為2 mL：0.2 mg×10支；GnRH為人工合成促性腺素釋放激素，蘇州市蘇牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為20 μg×10支，凍干粉針。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 CS101-A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），BCD-539WF海爾電冰箱（青島海爾股份有限公司），5 mL注射器（宣城市江南醫(yī)療器械有限公司），愛(ài)德士測(cè)孕試劑盒（美國(guó)愛(ài)德士生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別選擇體況評(píng)分為2.5～4和大于4的荷斯坦奶牛各15頭，分別為試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組。將兩組試驗(yàn)牛分別隨機(jī)分為3個(gè)處理組（A、B、C；n=5），進(jìn)行3種不同劑量PGF和GnRH的同期發(fā)情定時(shí)輸精程序處理（如圖1），并進(jìn)行子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分，分析奶牛的同期發(fā)情率和受胎率，確定同期發(fā)情定時(shí)輸精程序中最適的PGF和GnRH注射劑量（A組每次分別使用0.4 mg PGF2α和 40 μg GnRH；B 組每次分別使用 0.6 mg PGF2α和 60 μg GnRH；C 組每次分別使用 0.8 mg PGF2α和 80 μg GnRH）。

同期發(fā)情定時(shí)輸精程序（4次PGF2α2次GnRH法，簡(jiǎn)稱“4+2法”，如圖1）：試驗(yàn)開(kāi)始的當(dāng)天上午記為0 d，并且在當(dāng)天上午注射一次PGF2α，14 d后上午注射一次PGF2α，25 d后上午注射一次GnRH，30 d后上午注射一次 PGF2α，31 d 后上午注射一次 PGF2α，33 d 后上午注射GnRH同時(shí)進(jìn)行人工授精。

每次注射激素均在上午9：00，最后一次激素注射后12 h進(jìn)行人工授精。

圖1 “4+2法”同期發(fā)情定時(shí)輸精程序示意圖

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 發(fā)情觀察 試驗(yàn)期間定時(shí)對(duì)奶牛進(jìn)行發(fā)情觀察，及時(shí)記錄發(fā)情時(shí)間及次數(shù)。

1.3.2 評(píng)分記錄 以試驗(yàn)當(dāng)天記為0 d，并在試驗(yàn)前進(jìn)行一次子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分，試驗(yàn)期間每隔7天進(jìn)行子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分，并記錄統(tǒng)計(jì)。子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分均參照宮艷斌［10］的方法。

1.4 受孕母牛的檢測(cè)

定時(shí)對(duì)配種后的母牛進(jìn)行仔細(xì)的返情觀察，對(duì)未返情的母牛使用愛(ài)德士測(cè)孕試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行，確定受孕母牛數(shù)。

1.5 受胎率計(jì)算

受胎率是指配種后受孕母牛數(shù)和參配母牛數(shù)的比值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，通過(guò)SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情情況

由表1可知，試驗(yàn)Ⅰ組中的3個(gè)處理組試驗(yàn)?zāi)膛０l(fā)情主要集中在第5次注射激素后，發(fā)情率分別為40%、80%、60%，也是發(fā)情高峰期。其中A處理組中第1次和第4次注射激素后均未發(fā)現(xiàn)有發(fā)情牛，第5次注射激素后發(fā)情率最高達(dá)到40%；B處理組中每次注射完激素后均觀察到發(fā)情牛，第5次注射激素后發(fā)情率最高達(dá)到80%；C處理組中除了第4次注射激素后未發(fā)現(xiàn)有發(fā)情牛外，其余4次注射激素后均發(fā)現(xiàn)有發(fā)情牛，并且第5次注射激素后發(fā)情率最高達(dá)到60%。試驗(yàn)Ⅱ組中的3個(gè)處理組試驗(yàn)?zāi)膛０l(fā)情同樣主要集中在第5次注射激素后，并且第5次注射激素后發(fā)情率逐漸升高，分別為20%、40%、80%。其中，A處理組中除第3次和第5次注射激素后發(fā)情率均為20%外，其余3次注射激素后均未發(fā)現(xiàn)有發(fā)情牛；B處理組中第1次注射激素后未發(fā)現(xiàn)有發(fā)情牛，其余4次發(fā)情率分別為20%、20%、20%、40%；C處理組中每次注射完激素后均觀察到有發(fā)情，發(fā)情率分別為20%、20%、40%、20%、80%，第5次注射激素后發(fā)情率達(dá)到了最高。由此可知，試驗(yàn)Ⅰ組中B處理組奶牛同期發(fā)情率最高，為80%；試驗(yàn)Ⅱ組中A、B、C三個(gè)處理組最終的同期發(fā)情率逐漸升高，其中C組處理最高，為80%。

表1 發(fā)情率%

2.2 評(píng)分統(tǒng)計(jì)

2.2.1 子宮黏液評(píng)分 如表2所示，試驗(yàn)Ⅰ組中的A處理組和C處理組在試驗(yàn)過(guò)程中子宮黏液評(píng)分無(wú)顯著變化，A處理組整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)（P＞0.05），第35天時(shí)子宮黏液評(píng)分為3.48。C處理組整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（P＞0.05），第35天時(shí)子宮黏液評(píng)分為3.15。B處理組整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在第28天時(shí)子宮黏液評(píng)分顯著升高（P＜0.05），第35天時(shí)達(dá)到4.05。試驗(yàn)Ⅱ組中A處理組在試驗(yàn)過(guò)程中子宮黏液評(píng)分無(wú)顯著變化（P＞0.05），第35天時(shí)子宮黏液評(píng)分為3.38，B、C兩個(gè)處理組整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，B組在試驗(yàn)第35天時(shí)子宮黏液評(píng)分顯著升高，達(dá)到3.75（P＜0.05），C組在第28天時(shí)子宮黏液評(píng)分顯著升高到3.84（P＜0.05），第35天時(shí)子宮黏液評(píng)分達(dá)4.12（P＜0.05）。

2.2.2 直腸檢測(cè)評(píng)分 如表3所示，試驗(yàn)Ⅰ組中的A處理組在試驗(yàn)過(guò)程中直腸檢測(cè)評(píng)分無(wú)顯著變化（P＞0.05），A處理組整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)（P＞0.05），第35天時(shí)直腸檢測(cè)評(píng)分為3.26；B處理組在第14天時(shí)直腸檢測(cè)評(píng)分顯著升高到 3.25（P＜0.05），第 35 天時(shí)升高到 3.45；C 組整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，第35天時(shí)直腸檢測(cè)評(píng)分顯著降低到2.76（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組中的A處理組和B處理組在試驗(yàn)過(guò)程中直腸檢測(cè)評(píng)分無(wú)顯著變化（P＞0.05），第35天時(shí)直腸檢測(cè)評(píng)分分別為3.13和3.20；C處理組直腸檢測(cè)評(píng)分整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在第35天時(shí)顯著升高到3.54（P＜0.05）。

表2 子宮黏液評(píng)分

表3 直腸檢測(cè)評(píng)分

2.3 受胎率

如表4所示，試驗(yàn)Ⅰ組中的A、B、C三個(gè)處理組受胎率分別為40%、60%、20%，其中B處理組最高。試驗(yàn)Ⅱ組中A、B、C三個(gè)處理組受胎率分別為0%、20%、60%，其中C處理組最高。

表4 受胎率統(tǒng)計(jì)

3 討論

激素不僅是動(dòng)物體內(nèi)重要的組成部分，而且參與機(jī)體新陳代謝、繁殖機(jī)能和免疫機(jī)能［11-12］。吳長(zhǎng)明等［13］報(bào)道，微量元素是體內(nèi)許多酶、激素、維生素的組成成分或活性因子，在奶牛的繁殖生理中起著重要作用。若機(jī)體缺乏會(huì)引起性功能障礙，在雌性動(dòng)物發(fā)情周期的一定時(shí)期，通過(guò)注入外源性激素來(lái)提高血液中促性腺激素濃度，從而降低發(fā)育卵泡的閉鎖，增加早期卵泡發(fā)育到成熟卵泡的數(shù)量，從而使雌性動(dòng)物每次排卵數(shù)增加［14］。李子義等［15］在研究不同激素劑量對(duì)幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質(zhì)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同激素劑量對(duì)小鼠排卵數(shù)有不同的影響，小鼠對(duì)超排激素的耐受性是有一定閾值的，適量的激素劑量可以獲得更多的可移植胚胎，如果劑量小可能出現(xiàn)卵母細(xì)胞數(shù)量少，卵母細(xì)胞成熟率高；反之，如果激素劑量大，卵母細(xì)胞數(shù)量較多，但可能出現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟率低。因此，外源激素對(duì)奶牛排卵也有著重要的影響，進(jìn)而影響奶牛的繁殖性能。馮雨峰等［16］采用4種不同激素劑量組合處理小鼠，結(jié)果表明小鼠對(duì)超排激素的耐受性是有一定閾值的。劑量過(guò)低，超排激素不能滿足較多卵母細(xì)胞發(fā)育的需要，排卵數(shù)量下降，而劑量過(guò)高又易引起卵泡囊腫。高建明等［17］和高善頌等［18］也得出類似結(jié)論。外源激素是通過(guò)卵泡膜細(xì)胞上的FSH和LH受體來(lái)發(fā)揮促卵泡生長(zhǎng)的作用，只有卵泡發(fā)育至竇卵泡前期時(shí)，顆粒細(xì)胞才會(huì)出現(xiàn)特異的FSH表達(dá)，此時(shí)卵泡已經(jīng)完成由卵泡池中的始基卵泡的募集過(guò)程［19］。當(dāng)外源注射激素時(shí)，便減少了已募集的卵泡發(fā)生閉鎖，進(jìn)而使更多的同簇卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。

在試驗(yàn)Ⅰ組中，C處理組受胎率最低，這與它們的同期發(fā)情率低以及子宮粘液和直腸檢測(cè)評(píng)分較低相對(duì)應(yīng)。C處理組比A處理組同期發(fā)情率高，但受胎率卻相同，其原因主要是C處理組的激素劑量過(guò)大，導(dǎo)致了奶牛子宮和卵巢的萎縮，這也是C處理組直腸檢測(cè)評(píng)分顯著降低的主要原因，這與馮雨峰等在不同劑量激素對(duì)小鼠卵巢和子宮影響的研究結(jié)果一致［20］。B處理組同期發(fā)情率最高，子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分也顯著升高，這也表明卵巢和子宮功能恢復(fù)到正常，對(duì)卵巢和子宮復(fù)舊有積極的作用，因此受胎率也達(dá)到最高。在試驗(yàn)Ⅱ組中，A處理組的受胎率為0，這可能主要是激素劑量太小，沒(méi)有啟動(dòng)子宮和卵巢的正常生理機(jī)能，A處理組子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分較低也體現(xiàn)了子宮和卵巢功能的異常，因此同期發(fā)情率也相應(yīng)較低。隨著外源激素劑量的增加，受胎率也相應(yīng)升高。C處理組受胎率最高，為60%，子宮黏液評(píng)分和直腸檢測(cè)評(píng)分也有顯著改善。本研究結(jié)果表明，低劑量和高劑量激素對(duì)奶牛繁殖率均有不同程度的影響，這種影響根據(jù)奶牛的體況評(píng)分不同而異。奶牛體況評(píng)分是衡量奶牛體組織儲(chǔ)存狀況及監(jiān)控奶牛能量平衡的一種方法［21］。據(jù)Lopez等［22］報(bào)道，奶牛發(fā)生停止排卵的情況和體況評(píng)分的之間有較強(qiáng)的相關(guān)性。奶牛體況是奶牛飼養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)代謝正常與否的反映，也是奶牛健康與否的標(biāo)志之一，對(duì)生產(chǎn)性能、經(jīng)濟(jì)效益、健康狀況、產(chǎn)奶周期均有非常重要的影響［23］。因此，在奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中需要提高科學(xué)的營(yíng)養(yǎng)管理技術(shù)，維持奶牛適宜的體況評(píng)分，提高繁殖力和控制疾病，從而增加效益。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中使用PGF和GnRH兩種外源激素，通過(guò)同期發(fā)情定時(shí)輸精程序發(fā)現(xiàn)，根據(jù)奶牛體況評(píng)分不同使用不同劑量的外源激素具有較好的同期發(fā)情定時(shí)輸精效果。對(duì)于體況評(píng)分在2.5～4.0之間的適中奶牛，PGF2α和GnRH的劑量分別為0.6 mg和60 μg時(shí)，通過(guò)同期發(fā)情定時(shí)輸精程序使得奶牛的發(fā)情時(shí)間最為集中，同期發(fā)情效果最理想，受胎率最高，對(duì)于體況評(píng)分高于4.0的較肥奶牛，PGF2α和GnRH的劑量分別為0.8 mg和80 μg時(shí)，同期發(fā)情定時(shí)輸精效果較優(yōu)。