丁桂清，魏華芳，王立群，朱楚超，王 晶*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430070； 2.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430070)

復(fù)方阿膠漿是由阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂所組成的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效。近年來，由于該藥服用方便且口感較好，已被廣大患者所接受，并在貧血以及化療后骨髓抑制、免疫力低下等疾病的治療上取得了較好療效[1-2]。同時，該藥物在婦科疾病中的應(yīng)用也逐漸增多，臨床研究發(fā)現(xiàn)，其不但可以用于治療女性月經(jīng)不調(diào)[3-4]，而且可改善卵巢功能[5]，輔助促排卵治療，并增加患者子宮內(nèi)膜厚度，提高子宮內(nèi)膜容受性[6]。然而，目前關(guān)于復(fù)方阿膠漿對子宮內(nèi)膜功能方面影響的研究仍較少，我們?nèi)匀徊磺宄?fù)方阿膠漿是否對子宮內(nèi)膜有作用。本研究通過觀察去勢及假手術(shù)小鼠在復(fù)方阿膠漿灌胃后的子宮變化情況，探討其對子宮內(nèi)膜的作用及其可能的作用機(jī)制，旨在為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級C57雌性小鼠50只，8～9周齡，體質(zhì)量18～20 g，來源于湖北省疾控中心[SCXK (鄂) 2015-0018]。所有動物飼養(yǎng)于中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科[SYXK (鄂) 2017-0065]，光照周期為12 h，室溫(20±1)℃，自由飲食。通過陰道圖片連續(xù)觀察兩個動情周期，取動情周期正常小鼠40只用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

藥物：復(fù)方阿膠漿，主要成分為：阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂，規(guī)格：20 mL/支，山東東阿阿膠股份有限公司生產(chǎn)，國字準(zhǔn)號：Z20083345。

VEGF-A抗體購自Abcam(ab1316)；β-actin抗體購自Proteintech(20536-1-AP)；小鼠IgG-免疫組化試劑盒購自武漢博士德；HRT標(biāo)記羊抗鼠二抗購自Biosharp；DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶；BCA蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天；PVDF膜購自美國Millipore。RM2016石蠟切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；YD-6L生物組織包埋機(jī)：金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；恒溫培育箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Olympus BX51光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)：日本Olympus；RT-6500型酶標(biāo)儀：美國Rayto公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽：北京六一儀器廠；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀：北京六一儀器廠；TS-1型水平搖床：江蘇海門其林貝爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組

實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、假手術(shù)中藥組、去勢組及去勢中藥組，每組10只。

1.3.2 動物造模

去勢小鼠予完整摘除雙側(cè)卵巢，首先用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.4 mL/100 g)。使小鼠左側(cè)臥位，消毒后自小鼠背部肋骨下靠脊柱處開口進(jìn)入腹腔，用眼科鑷找出卵巢并將其完整摘除后縫合皮膚，右側(cè)同理，待小鼠自然蘇醒。假手術(shù)組操作步驟同兩去勢組，但只剪去卵巢周圍部分脂肪組織，不損傷卵巢。術(shù)后小鼠恢復(fù)3 d后行陰道涂片5 d，若兩去勢組小鼠動情周期消失，兩假手術(shù)組動情周期正常即為造模成功。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會批準(zhǔn)[倫理證號：20170239號]，動物飼養(yǎng)及處理按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.3 給藥方法

假手術(shù)中藥組及去勢中藥組每天上午予復(fù)方阿膠漿灌胃，根據(jù)人和動物體表面積等效劑量換算[7]，以許文生氏公式計算人的體表面積，再以Meeh-Rubner氏公式計算小鼠體表面積，將168 cm/55 kg女性用藥劑量換算為20 g小鼠得到0.25 mL/只，假手術(shù)組及去勢組給予等量生理鹽水，共計15 d。于第15天灌胃后，斷頸處死小鼠，取出子宮，一部分用多聚甲醛固定后石蠟包埋，另一部分-80℃凍存。

1.3.4 HE染色

將厚度為4 μm的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色1.5 min，水洗，1%鹽酸酒精分色10 s，自來水返藍(lán)5 min，伊紅染色10 s，無水乙醇終止反應(yīng)，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 免疫組化

切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O210 min，檸檬酸抗原熱修復(fù)5 min，自然冷卻后重復(fù)一次，10%山羊血清37℃封閉30 min，一抗VEGF-A(1∶200)4℃過夜，二抗(1∶150)、SABC(1∶150)37℃，30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對照。顯微鏡拍照，采用圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 Western blot

子宮組織提取蛋白后行蛋白濃度測定，統(tǒng)一蛋白濃度為6 μg/μL。使用SDS-PAGE電泳分離蛋白，每組上樣量為6 μL。150 mA恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗VEGF-A(1∶200)室溫孵育1.5 h，HRT標(biāo)記二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，洗膜后ECL發(fā)光液顯色曝光。并以β-actin作為內(nèi)參。測量各組VEGF-A的灰度值與β-actin比值后作為相對表達(dá)量進(jìn)行對比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化

與假手術(shù)組相比，假手術(shù)中藥組子宮增大，內(nèi)膜增厚，子宮腺體數(shù)目多，腺腔大，間質(zhì)水腫(圖1A、1B)；去勢組和去勢中藥組子宮結(jié)構(gòu)完整，但均出現(xiàn)萎縮，與去勢組相比，去勢中藥組子宮內(nèi)膜略厚，腺體結(jié)構(gòu)清楚，但差異不明顯(圖1C、1D)。

2.2 免疫組化觀察復(fù)方阿膠漿對VEGF-A表達(dá)的影響

VEGF-A在子宮中主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少。假手術(shù)中藥組中VEGF-A的表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P< 0.05)；雌鼠去勢后子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)明顯減少；去勢中藥組中VEGF-A的表達(dá)高于去勢組，但差異無顯著性。見圖2、表1。

2.3 Western blot檢測子宮VEGF-A蛋白表達(dá)量差異

將假手術(shù)組及假手術(shù)中藥組子宮組織進(jìn)行Western blot檢測，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，比較兩組間VEGF-A的蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示：復(fù)方阿膠漿灌胃可顯著上調(diào)假手術(shù)組子宮內(nèi)膜VEGF-A的表達(dá)。

注：A：假手術(shù)組；B：假手術(shù)中藥組；C：去勢組；D：去勢中藥組。圖1 各組子宮組織形態(tài)(HE染色，× 100)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 1 Uterine tissue morphology in each group. HE staining

組別Groups子宮內(nèi)膜VEGF-A表達(dá)(OD值)VEGF-A expression in endometrium (OD value)假手術(shù)組Sham operation group0.30±0.03假手術(shù)中藥組Sham operation with Chinese medicine group0.51±0.03*去勢組Ovariectomized group0.20±0.01去勢中藥組Ovariectomized with Chinese medicine group0.21±0.02

注：與假手術(shù)組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P< 0.05.

3 討論

復(fù)方阿膠漿主要由阿膠、紅參、熟地、黨參、山楂等中藥組成，為補(bǔ)益氣血之良品。方中君藥阿膠屬“血肉有情之品”，與熟地配伍起補(bǔ)血滋陰之功效；紅參大補(bǔ)元?dú)猓芤鏆馍?，根?jù)“氣能生血”理論，氣足則血亦旺。中醫(yī)認(rèn)為“肝主藏血”，而肝與腎“乙癸同源”，故氣足血旺，則腎精充沛，沖任有養(yǎng)。因此，中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為復(fù)方阿膠漿可用于治療氣血不足、腎氣虧虛、沖任不調(diào)等一系列病癥，推測其可用于調(diào)節(jié)“腎-天癸-沖任-胞宮”生殖軸的功能。現(xiàn)代研究亦發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎調(diào)沖任類中藥能夠起到調(diào)節(jié)生殖軸的作用[8]，例如改善卵巢功能、增加卵巢及子宮動脈血流、改善子宮內(nèi)膜微環(huán)境等。

姚麗雯等[9]研究發(fā)現(xiàn)單用復(fù)方阿膠漿對患者體內(nèi)激素水平的影響與單用克羅米芬無明顯差異，且當(dāng)二者合用時，可更有效地調(diào)節(jié)患者體內(nèi)性激素水平，促進(jìn)卵巢排卵。此外，有臨床研究表明，復(fù)方阿膠漿可用于調(diào)節(jié)女性月經(jīng)、治療卵巢早衰[3-5]，說明復(fù)方阿膠漿可調(diào)節(jié)女性體內(nèi)性激素的分泌，調(diào)節(jié)卵巢功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：復(fù)方阿膠漿對雌鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)有一定影響，其可促進(jìn)假手術(shù)組雌鼠子宮內(nèi)膜生長及腺體發(fā)育。而當(dāng)雌鼠去勢后卵巢缺失時，子宮出現(xiàn)萎縮，復(fù)方阿膠漿促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長及腺體發(fā)育的作用效果并不顯著。因此，我們推測復(fù)方阿膠漿可能是通過調(diào)節(jié)卵巢的內(nèi)分泌功能從而間接影響子宮內(nèi)膜的生長及腺體發(fā)育。

注：A：假手術(shù)組；B：假手術(shù)中藥組；C：去勢組；D：去勢中藥組。圖2 各組小鼠子宮組織中VEGF-A的表達(dá)(× 400)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 2 The expression of VEGF-A in the uterine tissues in each group

注：與假手術(shù)組相比，* P< 0.05。圖3 子宮VEGF-A蛋白表達(dá)量Western blot檢測結(jié)果Note. Compared with the sham operation group,* P< 0.05.Figure 3 Western blot results of VEGF-A protein expression in uterus

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族是一系列參與血管再生的糖蛋白，目前人們在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盤生長因子。其中VEGF-A為一種特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生、誘導(dǎo)血管產(chǎn)生及改善血管通透性等作用[10]。VEGF-A的表達(dá)異常常導(dǎo)致許多與血管新生相關(guān)疾病的發(fā)生，如腫瘤、視網(wǎng)膜病變、腎臟病變、子宮內(nèi)膜異位癥等[11-12]。同時，VEGF-A與女性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，其表達(dá)于女性子宮內(nèi)膜，并隨月經(jīng)周期發(fā)生周期性變化。國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)動物行卵巢切除術(shù)后，子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)量明顯減少[13-14]。此次實(shí)驗(yàn)中，我們亦發(fā)現(xiàn)小鼠去勢后，子宮出現(xiàn)萎縮，且子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)量也明顯減少，這與之前的研究結(jié)果相一致[13-14]，證明卵巢可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)水平。由于雌、孕激素可以使子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌的VEGF-A水平增加[15]，Huang等[16]亦通過實(shí)驗(yàn)證明了雌激素能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜中VEGF-A的遷移及表達(dá)，說明VEGF-A的表達(dá)受雌、孕激素的調(diào)節(jié)。此次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿灌胃使假手術(shù)組小鼠子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)上升，但并未對去勢小鼠子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)量產(chǎn)生明顯影響，因此，我們猜想：復(fù)方阿膠漿可能通過調(diào)節(jié)卵巢雌、孕激素的分泌，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜的功能。

在女性妊娠過程中VEGF-A起著至關(guān)重要的作用[17]，當(dāng)處于種植窗口期時，子宮內(nèi)膜中的VEGF-A表達(dá)量明顯增多，其可通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜微環(huán)境而促進(jìn)胚胎植入[18]，而當(dāng)其缺失時，胚胎無法完成成功植入。在輔助生殖的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，促排卵后子宮內(nèi)膜中VEGF-A表達(dá)較正常子宮明顯減少，VEGF-A表達(dá)的減少也被認(rèn)為是影響胚胎植入的因素之一[19]，近年來VEGF-A已被許多學(xué)者視為評價子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)之一。因此次研究中我們發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿可增加子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜中VEGF-A的表達(dá)量，故推測其可通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜環(huán)境而改善子宮內(nèi)膜容受性。近年來，輔助生殖技術(shù)雖在不斷發(fā)展，但臨床妊娠率仍未滿足患者期望，許多育齡期婦女因排卵障礙、卵巢早衰、子宮內(nèi)膜容受性差等原因而不能成功妊娠，復(fù)方阿膠漿作為一種中藥復(fù)方之劑，其無明顯副作用，且可調(diào)節(jié)女性生殖內(nèi)分泌軸，調(diào)節(jié)卵巢功能，改善子宮內(nèi)膜容受性，或可成為臨床輔助不孕癥治療的新選擇。

總之，通過此次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)復(fù)方阿膠漿對子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)及微環(huán)境確實(shí)存在一定影響，其可能是通過調(diào)節(jié)卵巢功能而間接作用于子宮，但有關(guān)其對卵巢的作用及作用機(jī)制，是否能夠直接影響卵巢雌、孕激素的分泌，還有待進(jìn)一步研究。