潘金春，閔凡貴，王希龍*

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663； 2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)基因是1990年Issemann等[1]首先發(fā)現(xiàn)的能被過(guò)氧化物酶體增殖劑(PP)激活的物質(zhì)，因此命名為PP激活受體(PPAR)。PPAR屬于核激素受體超家族，有3個(gè)亞型分別為α、β、γ，其中PPARγ是最重要的PPAR。人的PPARγ位于3號(hào)染色體，而豬位于13號(hào)染色體上。PPARγ可產(chǎn)生4種mRNA異構(gòu)體，編碼2種蛋白，其中PPARγ1、PPARγ3、PPARγ4編碼相同的蛋白，PPARγ2編碼蛋白比PPARγ1編碼蛋白在N末端多了28～30個(gè)氨基酸，而激活效率則高5～6倍[2-3]，因此PPARγ2基因是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。PPARγ基因的多態(tài)性與疾病密切相關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，包括C1431T、Pro12Ala、rs1801282等，這些SNPs可能與糖尿病、肥胖、心血管等疾病相關(guān)[4-6]。

五指山小型豬(Wuzhishan minipigs，WZSP)是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的小型豬之一，具有體型矮小、性成熟早、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定、代謝率低等諸多優(yōu)點(diǎn)。有研究證明，五指山小型豬對(duì)高糖高脂飼料敏感，可建立2型糖尿病模型[7]；本研究前期對(duì)封閉群五指山小型豬的糖耐量和血脂進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)有部分小型豬糖代謝和脂代謝異常[8]；五指山小型豬的PPARγ基因存在多態(tài)性[9]。五指山小型豬具有獨(dú)特的脂肪吸收和代謝能力，可用于建立高血脂、糖尿病等模型。本研究對(duì)WZSP豬群的PPARγ2基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域SNPs進(jìn)行掃描，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)SNPs進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析SNPs對(duì)該基因的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)封閉群五指山小型豬57頭，雌雄不限，體重16.2～33.8 kg，為6月齡以上的成年豬，來(lái)源于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所和廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司合作建立的實(shí)驗(yàn)用WZSP繁育基地[SCXK (粵) 2013-0022]。動(dòng)物飼養(yǎng)于普通級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)[SYXK (粵) 2018-0087]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，動(dòng)物抓取、采血等過(guò)程中盡量減少對(duì)其應(yīng)激，動(dòng)物置于吊床上保定后采血。

1.2 主要試劑與儀器

血液DNA抽提試劑盒，Omega公司；Premix Ex Taq Hot Start試劑，Takara；DL2000 DNA marker，Takara；引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；TBE緩沖液、超純水為本實(shí)驗(yàn)室提供。PCR儀，Biometra公司，型號(hào)TProfessional Standard Gradient；電泳儀，北京六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)PowerPac Basic 164-5050；漩渦振蕩器，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠，型號(hào)QL861；高速離心機(jī)，Sigma公司，型號(hào)3k18；干式恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)K20-B。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA抽提

從前肢皮下頭靜脈或后肢隱靜脈采取五指山小型豬抗凝血3 mL，用試劑盒抽提血液基因組DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及PCR

在UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找豬PPARγ基因序列(http://genome.ucsc.edu/，基因位置chr13: 75455897-75663489)，結(jié)合豬PPARγ2基因啟動(dòng)子(GeneBank登錄號(hào)：AY044238.1)和mRNA(GeneBank登錄號(hào)：DQ437885.1)序列確定豬PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前后共2200 bp左右的調(diào)控序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)5對(duì)引物，以該基因mRNA第1位堿基為+1位，引物信息及產(chǎn)物大小見表1，產(chǎn)物總長(zhǎng)度為2068 bp(-2011～57 bp)。PCR反應(yīng)體系為80 μL，其中DNA模板8 μL，Premix Ex Taq Hot Start試劑40 μL，上下游混合引物(濃度10 μmol/L)4 μL，超純水28 μL。采用PCR儀擴(kuò)增，PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，再用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶情況。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

將有目的條帶的PCR產(chǎn)物直接送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Contig Express 9.1軟件拼接，結(jié)合DNAstar 7.1軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行修正、比較，再用Variant reporter軟件分析確定SNPs。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

利用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、CpG島進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，可以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。各種軟件方法參見表2。

表1 引物序列、位置及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences, position, and length of the PCR products

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR產(chǎn)物分為5段條帶，大小為536～670 bp之間，產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNPs，其在DNA序列上的位置參見圖2，各SNPs基因型頻率及突變類型見表3。

2.2 五指山小型豬PPARγ2基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

根據(jù)4種不同軟件對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)，上述SNPs都沒有處在軟件識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū)域中，結(jié)果參見表4。

2.3 五指山小型豬PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用4種不同軟件對(duì)五指山小型豬的PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)該基因包含TATA box、Pu box、NF-κB、GATA-1等多種對(duì)PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄起重要作用的結(jié)合位點(diǎn)。突變后的序列提交分析后可見轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量發(fā)生了改變(表5)，并且改變都發(fā)生在突變的SNP位點(diǎn)附近。

2.4 五指山小型豬PPARγ2基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將突變前后的PPARγ2基因DNA提交軟件預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，突變引起RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能發(fā)生變化，由-1.580 × 106J/mol變?yōu)?1.566 × 106J/mol。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯改變，多處莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化(圖3)。

注：從左向右各孔道分別為：DL2000 marker，100～2000 bp；引物P1的PCR產(chǎn)物，568 bp；引物P2的PCR產(chǎn)物，536 bp；引物P3的PCR產(chǎn)物，591 bp；引物P4的PCR產(chǎn)物，581 bp；引物P5的PCR產(chǎn)物，670 bp。圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Note. From left to right, the lanes are: DL2000 marker, 100-2000 bp; PCR products of primers P1, 568 bp; PCR products of primers P2, 536 bp; PCR products of primers P3, 591 bp; PCR products of primers P4, 581 bp; PCR products of primers P5, 670 bp.Figure 1 Results of gel electrophoresis of PCR products

圖2 五指山小型豬PPARγ2基因SNPs在DNA序列上的位置Figure 2 The locations of PPARγ2 SNPs of Wuzhishan minipigs in the DNA sequence

SNPs動(dòng)物數(shù)量Number of animals基因型 GenotypeTT/AATC/AG/ACCC/GG突變類型Mutation types-1595T/C56018(0.32)38(0.68)轉(zhuǎn)換 Transition-1534G/A57015(0.26)42(0.74)轉(zhuǎn)換 Transition-1262C/A5719(0.33)22(0.39)16(0.28)顛換 Transversion-1220C/A5737(0.65)18(0.32)2(0.04)顛換 Transversion-1017A/G5741(0.72)16(0.28)0轉(zhuǎn)換 Transition-963A/G5718(0.32)22(0.39)17(0.30)轉(zhuǎn)換 Transition-955G/A5735(0.61)22(0.39)0轉(zhuǎn)換 Transition-866A/G5716(0.28)22(0.39)19(0.33)插入 Insertion-333G/A5737(0.65)20(0.35)0轉(zhuǎn)換 Transition

表4 五指山小型豬PPARγ2基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Results of PPARγ2 promoter prediction in Wuzhishan minipigs

表5 不同軟件預(yù)測(cè)五指山小型豬PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量Table 5 Numbers of transcriptional factor-binding sites of PPARγ2 gene predicted by different software in Wuzhishan minipigs

注：Tfsitescan軟件：高分為10分；TFSEARCH軟件：高分為100分，最低分為85分；GeneBuilder軟件：核心相似度1.0，矩陣相似度0.85；AliBaba 2.1軟件參數(shù)：配對(duì)已知位點(diǎn)數(shù)=50，矩陣寬度=10 bp，位點(diǎn)最小數(shù)量=4，最小矩陣保守度=75%，與矩陣序列相似度=1%，因子水平=4(例如：RAR-b’)。

Note. Software Tfsitescan: 10 is the high score. Software TFSEARCH: 100 is the high score; 85 is the threshold score. Software GeneBuilder: Core similarity is 1.0; Matrix similarity is 0.85. Software AliBaba 2.1 parameters: Pairsim to known site=50; Matrix width=10 bp; Minimum number of sites=4; Minimum matrix conservation=75%; Similarity of sequence to matrix=1%; Factor class level=4 (e.g.: RAR-b’).

注：紅色數(shù)字為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的自由能；黑色數(shù)字為堿基的位置(從提交的第一個(gè)堿基計(jì)算)；綠色線條表示RNA堿基鏈。圖3 PPARγ2基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Note. Red numbers indicate the free energy of the stem ring structures. Black numbers indicate the positions of the base (calculated from the first base submitted). Green lines indicate RNA base chains.Figure 3 RNA secondary structure prediction of the PPARγ2 gene

2.5 PPARγ2基因CpG島預(yù)測(cè)

用5種不同的軟件預(yù)測(cè)PPARγ2基因CpG島，參數(shù)設(shè)為：Obs/Exp值大于0.6，GC含量大于50%，范圍大于200 bp。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)CpG島的存在。

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與疾病相關(guān)的PPARγ基因多態(tài)位點(diǎn)，Yen等人[10]首次報(bào)道了PPARγ2基因的兩個(gè)常見多態(tài)位點(diǎn)C1431T和Pro12Ala可能與糖尿病、肥胖等疾病有關(guān)。啟動(dòng)子區(qū)域的突變位點(diǎn)-1279G/A突變體在Pro12Ala突變體Pro/Pro基因型存在的情況下，可提高對(duì)2型糖尿病的易感性；而在12Ala等位基因存在時(shí)，則表現(xiàn)對(duì)2型糖尿病的保護(hù)作用[11]。Chan等人[12]發(fā)現(xiàn)rs6809631、rs9817428、rs10510411、rs12629293和rs12636454這5個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域SNPs與2型糖尿病顯著相關(guān)。PPARγ2的啟動(dòng)子區(qū)域突變C-2821T可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ2基因的表達(dá)來(lái)影響其激活[13]。

本研究一共篩選到9個(gè)SNPs，包括-1595T/C、-1534G/A、-1262C/A、-1220C/A、-1017A/G、-963A/G、-955G/A、-866A/G、-333G/A。用4個(gè)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)五指山小型豬的PPARγ2基因在-1473 bp和-184 bp位置可能存在兩個(gè)啟動(dòng)子，這9個(gè)SNPs都沒有處于預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域，可能作用于其他調(diào)控區(qū)域而影響基因的表達(dá)。其中-333G/A突變位于核心啟動(dòng)子(-656～-23 bp)區(qū)域，可能對(duì)PPARγ2基因的表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)控作用。

利用4種不同軟件對(duì)五指山小型豬的PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變前后的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量都發(fā)生了改變，這些改變都發(fā)生在突變的SNPs位點(diǎn)附近。說(shuō)明這9個(gè)SNPs都可導(dǎo)致PPARγ2基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，從而可能影響該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)該基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其最小自由能發(fā)生變化，二級(jí)結(jié)構(gòu)也有顯著變化，可能影響RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)一步說(shuō)明突變位點(diǎn)可能對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生影響。通過(guò)5種軟件均未能預(yù)測(cè)出五指山小型豬的PPARγ2基因有CpG島的存在，說(shuō)明通過(guò)改變甲基化水平調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的可能性較小。

人的PPARγ2基因存在一些突變位點(diǎn)與本研究獲得的突變位點(diǎn)位置接近，如-1279G/A突變體可能與2型糖尿病的易感性有關(guān)[11]，這個(gè)位點(diǎn)與本研究中-1262C/A突變體位置靠近，且該突變?nèi)N基因型頻率接近(0.33∶0.39∶0.28)。此外，-963A/G(0.32∶0.39∶0.30)和-866A/G(0.28∶0.39∶0.33)突變的基因型頻率也比較接近，均衡的基因型有利于篩選需要的突變體。有研究者在二花臉豬PPARγ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域鑒定出兩個(gè)SNPs，-1633C>T和-1572G>A，并進(jìn)一步證實(shí)T-A單體型可能與更高的肌內(nèi)脂肪含量有關(guān)[14]，這兩個(gè)位點(diǎn)與本研究中-1595T/C突變位置接近。另外，-333G/A突變位于核心啟動(dòng)子可能對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。這幾個(gè)SNPs都可以引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的變化，有必要進(jìn)一步研究其功能。