施玉婷，李 峰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)長(zhǎng)學(xué)制臨床醫(yī)學(xué)(兒科醫(yī)學(xué)方向)，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京 100013； 2.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京腦重大疾病研究院，北京神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等是一類不明原因的以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(motor neurons，MNs)進(jìn)行性變性為主要特征的疾病，會(huì)引起肌萎縮無(wú)力、運(yùn)動(dòng)障礙，甚至癱瘓、死亡。對(duì)此尚無(wú)有效的治療方法，細(xì)胞替代治療是當(dāng)前研究的主要手段，移植細(xì)胞主要包括MNs、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)等。如何在體外獲得大量上述細(xì)胞是問(wèn)題的關(guān)鍵。

1998年11月，威斯康星大學(xué)的科學(xué)家[1]培育出了具有分化潛能的人ESCs，可利用其得到靶細(xì)胞甚至靶器官用以移植。但在對(duì)ESCs的研究中發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有致瘤性，異體移植存在免疫排斥，同時(shí)還存在倫理學(xué)爭(zhēng)議，很大程度上限制了其應(yīng)用。2006年日本京都大學(xué)的Yamanaka等人[2]將4個(gè)基因(OCT4，SOX2，C-MYC，KLF4)導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)內(nèi)，轉(zhuǎn)化得到形態(tài)和功能都和ESCs很相似的多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞重編程技術(shù)的新時(shí)代。這種細(xì)胞來(lái)源于自身已成熟的體細(xì)胞，能避免免疫排斥。隨后研究者們開(kāi)始探索如何將已分化的細(xì)胞在特定條件下逆轉(zhuǎn)為iPSCs，或是直接得到靶細(xì)胞，如MNs。本文就體外分化得到MNs的研究方法進(jìn)行歸納和總結(jié)。

多種細(xì)胞均可用于體外分化，如間充質(zhì)干細(xì)胞[3]、骨髓細(xì)胞[4]、成熟B淋巴細(xì)胞[5]，但因成纖維細(xì)胞易于獲得，目前研究最多。本文探討以下三種由成纖維細(xì)胞獲得MNs的方法，即經(jīng)iPSCs中間狀態(tài)、直接轉(zhuǎn)化和經(jīng)NSCs中間狀態(tài)。

1 成纖維細(xì)胞經(jīng)iPSCs中間狀態(tài)轉(zhuǎn)化成MNs

1.1 成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成iPSCs

迄今已有很多方法可將體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，包括體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合、細(xì)胞提取物重編程和直接重編程。其中，直接重編程是向體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入特定的轉(zhuǎn)錄因子或基因來(lái)誘導(dǎo)，如，SOX2、OCT4、C-MYC和KLF4，它們都與細(xì)胞全能性或多能性的維持有關(guān)。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率和速度與體細(xì)胞的來(lái)源、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)入途徑和培養(yǎng)條件等因素息息相關(guān)。有些體細(xì)胞在重編程的過(guò)程中易于獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，這是由于不同分化程度和種類細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合緊密程度不同，導(dǎo)致外源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到細(xì)胞DNA中的難易程度不同。Yamanaka等人[2]所用的四因子是細(xì)胞重編程實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄因子，用其他因子替換原本的一種或幾種轉(zhuǎn)錄因子，也能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重編程，但轉(zhuǎn)化時(shí)效可發(fā)生改變。比如有些體細(xì)胞自身可內(nèi)源性表達(dá)一種或幾種特定Yamanaka因子，不需要外源添加，如成纖維細(xì)胞可表達(dá)C-MYC和KLF4，在重編程過(guò)程中就可不用添加KLF4因子，但會(huì)減小轉(zhuǎn)化效率并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間。2006年Yamanaka等人[2]成功得到iPSCs后，由Takahashi等[6]、Brambrink等[7]、Kim等[8]、Ban等[9]、Mandal和Rossi[10]等進(jìn)行的多項(xiàng)重編程實(shí)驗(yàn)陸續(xù)開(kāi)展，他們通過(guò)把以Yamanaka因子為主的不同轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、仙臺(tái)病毒、改良后的mRNA這幾種載體中，將人成纖維細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs，轉(zhuǎn)化時(shí)間由12 d到40 d不等，轉(zhuǎn)化效率由0.001%～4.4%不等，進(jìn)一步證實(shí)了重編程方法的可行性。

此外，利用一些小分子物質(zhì)部分或者完全替代重編程因子可提高轉(zhuǎn)化效率，由此得到的iPSCs被稱為化學(xué)誘導(dǎo)多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(chemically induced pluripotent stem cells，ciPSCs)。這些小分子物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老和代謝等機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用[11]。Hou等人[12]利用7種小分子完全替代外源性轉(zhuǎn)錄因子，成功地由MEFs得到iPSCs，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.2%，相比于Yamanaka等[2]的轉(zhuǎn)化方法(0.01%～0.1%)效率提高將近200倍，這7種分子分別是forskolin(FSK)、2-甲基-5羥色胺(2-Me-5HT)、D4476、VPA、CHIR99021(CHIR)、616452和tranylcypromine，前三種可以代替OCT4，后四種可聯(lián)合OCT4完成細(xì)胞重編程。不過(guò)迄今仍未有人源ciPSCs體外獲得的報(bào)道。

1.2 iPSCs轉(zhuǎn)化為MNs

iPSCs轉(zhuǎn)化成MNs的過(guò)程可以分成兩個(gè)階段，第一階段通過(guò)向iPSCs培養(yǎng)基內(nèi)添加不同的小分子得到擬胚體(embryoidbody，EB)或神經(jīng)玫瑰花樣結(jié)構(gòu)(neural rosette)，即神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)；第二階段通過(guò)添加特定因子可將NPCs分化成為MNs，這一過(guò)程主要依賴于RA的尾端化和SHH的腹側(cè)化。

Santos等人[13]在EB培養(yǎng)階段的第1～7天添加了SB431542和DM，隨后在培養(yǎng)的第5～24天添加RA和SAG1.3(分別促進(jìn)神經(jīng)元的尾側(cè)化和腹側(cè)化)，第24天選出單個(gè)細(xì)胞并將其置于MNs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2 d后可得到有絲分裂后的MNs，轉(zhuǎn)化效率為15%～25%。

Shimojo等人[14]在分化早期應(yīng)用GSK-3β抑制劑和SMAD抑制劑，用以抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞的分化增殖，一周內(nèi)誘導(dǎo)得到表達(dá)PAX6和SOX1基因的NPCs，隨后應(yīng)用RA和purmorphamine活化SHH信號(hào)通路以促進(jìn)NPCs的分化和增殖，兩周內(nèi)可得到表達(dá)HB9和ISL-1的MNs，之后在促進(jìn)MNs成熟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，可以得到成熟的MNs。

iPSCs技術(shù)在應(yīng)用上的局限性主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：一是誘導(dǎo)過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)(一般為3～4周)；二是轉(zhuǎn)化效率較低(一般為0.001%～0.01%)；三是臨床應(yīng)用的安全性欠缺。在向供體細(xì)胞中引入外源基因時(shí)，病毒載體可能將外源基因整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致供體細(xì)胞發(fā)生基因突變，此外，C-MYC和KLF4是致癌基因，因此iPSCs技術(shù)的安全性有待提高，轉(zhuǎn)入因子及載體的選擇需進(jìn)一步改進(jìn)。

2 成纖維細(xì)胞體外直接轉(zhuǎn)化為MNs

細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化的第一個(gè)證據(jù)來(lái)源于PAX6，這個(gè)基因的缺失會(huì)影響前腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元的形成，而單個(gè)此基因能使從大腦皮層分離的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元[15]。由此發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞的分化狀態(tài)是可逆的，采用過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或添加小分子等方法可改變細(xì)胞類型，這種方法即為細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化。

2.1 單純利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化

20世紀(jì)80年代，Davis等人[16]首次利用單一轉(zhuǎn)錄因子MYOD(在內(nèi)源性肌細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的因子)成功將MEFs轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞，給細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了希望，隨后研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的轉(zhuǎn)錄因子。

Vierbuchen等人[17]首先找出了19種在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用的基因，轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞，成功得到誘導(dǎo)性神經(jīng)元(induced neuronal cells，iNs)。隨后，為減少轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量，他們利用BRN2、MYTLl、ZIC1、OLIG2和ASCL1五因子成功得到了有高度復(fù)雜形態(tài)的iNs；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)BAM(BRN2、ASCL1、MYTLl)或BAZ(BRN2、ASCL1、ZIC1)三因子得到神經(jīng)元的效率比五因子高2～3倍，其中BAM三因子得到的神經(jīng)元比BAZ三因子具有更復(fù)雜的生物學(xué)形態(tài)和功能特性。但該實(shí)驗(yàn)得到的神經(jīng)元并不特異，要得到MNs還需要添加額外的轉(zhuǎn)錄因子，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

Son等人[18]首先挑選出MNs分化過(guò)程中起重要作用的8種轉(zhuǎn)錄因子(SOX1、PAX6、NKX6.1、OLIG2、NGN2、LHX3、ISL1、HB9)，以及上述BAM三因子，先后單獨(dú)利用BAM三因子和8種MNs分化因子，結(jié)果均未由MEFs直接得到MNs，而聯(lián)合應(yīng)用這11種因子能夠獲得MNs。通過(guò)逐一排除，最終確定7因子轉(zhuǎn)化體系(BAM三因子加上LHX3、ISL1、NGN2和HB9四種轉(zhuǎn)錄因子)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5%～10%。在此基礎(chǔ)上若添加NEUROD1，就可將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成MNs。

Zhang等人[19]將上述8種轉(zhuǎn)錄因子(包括NEUROD1)轉(zhuǎn)入SMA患者的成纖維細(xì)胞可得到患者特異性的MNs，轉(zhuǎn)染后第43天，部分細(xì)胞可表達(dá)MNs標(biāo)志物ISL1、CHAT和HB9。在此實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組和SMA組的轉(zhuǎn)化效率分別是5.5%和5.8%，相差不大。但與對(duì)照組相比，SMA組得到的誘導(dǎo)性MNs(iMNs)在第45～48天神經(jīng)突起的生長(zhǎng)速率顯著減慢，60 d后神經(jīng)元明顯退化，數(shù)量顯著減少。這一結(jié)果與SMA患者的臨床表現(xiàn)相一致，證實(shí)了SMA的發(fā)生機(jī)制的確與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害相關(guān)，因此iMNs可作為SMA發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選的細(xì)胞模型。

2.2 聯(lián)合應(yīng)用小分子和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化

由于單純利用轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)化效率較低，研究者們開(kāi)始尋找有效的小分子物質(zhì)來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率。Liu等人[20]首先選出7種與神經(jīng)元發(fā)育和存活相關(guān)的小分子，嘗試聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子NGN2將人胚肺成纖維細(xì)胞(human fetal lung fibroblasts，HFLFs)轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元，結(jié)果證實(shí)FSK和DM能使NGN2將HFLFs成功轉(zhuǎn)化成MNs。但應(yīng)用于出生后和成人的皮膚成纖維細(xì)胞，獲得神經(jīng)元的效率很低，添加轉(zhuǎn)錄因子SOX11和小分子FGF2，并將培養(yǎng)時(shí)間由4 d延長(zhǎng)至10 d，能顯著提高神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化效率(第21天20.3%～57.2%表達(dá)TUJ1)，與單獨(dú)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子相比增高4～10倍。但此方法培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，得到的膽堿能神經(jīng)元不表達(dá)ISL1和LHX3這兩種對(duì)于MNs發(fā)育非常重要的蛋白，Liu等人[21]在此基礎(chǔ)上又用攜有NGN2、SOX11、ISL1和LHX3的慢病毒載體感染ALS患者的皮膚成纖維細(xì)胞，并添加小分子FSK、DM和FGF2，成功得到ALS患者的iMNs。這種iMNs雖然具備一般MNs的細(xì)胞和電生理特性，但存活困難、胞體縮小、活動(dòng)度降低，無(wú)法形成神經(jīng)肌肉接頭，用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)kenpaullone可以顯著促進(jìn)其樹(shù)突向外生長(zhǎng)，恢復(fù)胞體大小，并能使神經(jīng)元的興奮性趨于正常，幫助提高其形成神經(jīng)肌肉接頭和控制肌肉運(yùn)動(dòng)的能力。

2.3 單純利用小分子進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化

應(yīng)用載體攜帶外源基因進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染存在基因整合突變的安全隱患，既然小分子物質(zhì)部分替代轉(zhuǎn)錄因子能夠提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，有必要研究單純利用小分子能否實(shí)現(xiàn)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化。

Li等[22]首次單純利用小分子物質(zhì)forskolin、ISX9、CHIR99021和I-BET151進(jìn)行小鼠成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，成功得到有原始神經(jīng)元形態(tài)并能表達(dá)TUJ1的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率大于90%，這種單純應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化得到的神經(jīng)元被命名為化學(xué)誘導(dǎo)神經(jīng)元(chemical-induced neurons)。此方法便于操作和標(biāo)準(zhǔn)化，可避免病毒載體帶來(lái)的免疫原性和基因整合等安全性問(wèn)題，是一種新的體外細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化的研究思路。

既往將小鼠成纖維細(xì)胞體外直接轉(zhuǎn)化成iNs或iMNs的實(shí)驗(yàn)多采用BAM這三種轉(zhuǎn)錄因子，而人成纖維細(xì)胞需要額外添加NGN2，并且聯(lián)合應(yīng)用小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率要顯著高于單純利用轉(zhuǎn)錄因子。成纖維細(xì)胞直接分化為iMNs的方法相比于經(jīng)過(guò)iPSCs這一中間狀態(tài)來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)化時(shí)間更短，效率更高，但臨床應(yīng)用上存在缺陷，因?yàn)橥ǔＲ浦布?xì)胞的需求量大，而成熟iMNs無(wú)法進(jìn)行分裂增殖，所以患者能應(yīng)用的體細(xì)胞數(shù)量有限，因此有必要考慮將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成可以大量增殖且具有多能性的NSCs，再將其進(jìn)一步分化為MNs。

3 成纖維細(xì)胞經(jīng)NSCs這一中間狀態(tài)分化為MNs

目前獲得iNSCs的方法主要有兩種：直接誘導(dǎo)法和間接誘導(dǎo)法。直接誘導(dǎo)法就是在體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入NSCs表達(dá)的特定基因，或者利用microRNA等其他小分子直接得到iNSCs；間接誘導(dǎo)法就是在體細(xì)胞重編程為iPSCs的過(guò)程中改變誘導(dǎo)環(huán)境，使其成為iNSCs。

3.1 直接誘導(dǎo)法

Zhu等人[23]用OCT4單個(gè)基因聯(lián)合A83-01、CHIR99021、NAB、LPA、rolipram和SP600125成功將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成能表達(dá)PAX6、NESTIN和SOX1等泛神經(jīng)化標(biāo)志物的iNSCs，4周后可分化出成熟神經(jīng)元，移植到小鼠腦內(nèi)，無(wú)腫瘤形成。

Zhao等和Capetian等[24- 25]將轉(zhuǎn)錄因子OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和抑制p53基因表達(dá)的干擾RNA轉(zhuǎn)入健康人的皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)，在含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子bFGF、EGF和FGF4的特定神經(jīng)元培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d后得到iNSCs。

3.2 間接誘導(dǎo)法

在iPSCs的誘導(dǎo)早期改變誘導(dǎo)環(huán)境，使其向NSCs方向發(fā)展即可間接獲得iNSCs。Lu等人[26]用攜有Yamanaka四因子的仙臺(tái)RNA病毒感染人成纖維細(xì)胞，再將其置于含有重組人白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)(一種與多種細(xì)胞的增殖分化相關(guān)的多功能細(xì)胞因子)、SB431542和CHIR99021小分子的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可得到LIF依賴性iNSCs(LIF dependent-iNSCs，LD-iNSCs)。但此細(xì)胞的神經(jīng)分化潛能需要外源性轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)存在才可維持，否則長(zhǎng)期傳代(> 20代)會(huì)逐漸喪失其潛能。

Miura等人[27]利用攜有OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC和NANOG這五種基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜的纖維化基質(zhì)細(xì)胞(endometrial fibrotic stromal cells)，并將其置于含有LIF和2i(MEK1/MEK2抑制劑PD0325901和GSK-3β抑制劑CHIR99021)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，可得到人LD-iNSCs，轉(zhuǎn)化效率大概是0.01%～0.03%。得到的LD-iNSCs可繼續(xù)分化為MNs、多巴胺能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并能在體外擴(kuò)增100代以上。

盡管通過(guò)直接或間接誘導(dǎo)將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iNSCs的方法能增加MNs數(shù)量，彌補(bǔ)直接轉(zhuǎn)化的缺陷，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低，應(yīng)用病毒載體存在安全性問(wèn)題，因此此類方法仍有待完善。細(xì)胞分化中所用小分子物質(zhì)及其作用的匯總見(jiàn)表1。

4 存在問(wèn)題及應(yīng)用前景

自2006年Yamanaka等人[2]首次利用MEFs得到iPSCs以來(lái)，細(xì)胞重編程技術(shù)逐漸興起，各國(guó)學(xué)者從體細(xì)胞來(lái)源、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)入途徑和培養(yǎng)條件等各個(gè)方面尋求突破，本文主要介紹了成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化得到MNs的三類方法，其中由成纖維細(xì)胞體外得到膽堿能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)95%[20]。這些體外得到的MNs不僅能用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的替代治療，還可用于疾病發(fā)病機(jī)制的研究和藥物篩選。

目前仍然有一些問(wèn)題需要繼續(xù)研究。一是載體的選擇：盡管非基因整合載體沒(méi)有基因整合過(guò)程，相對(duì)安全，但其轉(zhuǎn)化效率相比于基因整合載體更低(除mRNA外)，需要關(guān)注如何提高非基因整合載體的轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題；二是小分子物質(zhì)的選擇，雖然小分子物質(zhì)應(yīng)用于重編程技術(shù)能提高轉(zhuǎn)化效率，但大多數(shù)小分子在重編程過(guò)程中的特定影響和作用機(jī)制并不清楚，不同的小分子可能會(huì)相互影響或者對(duì)人體產(chǎn)生毒性，因此在臨床應(yīng)用上受到限制，應(yīng)用的最適濃度、暴露時(shí)間、協(xié)同效應(yīng)等方面都需要更多的研究?？傊靡殉墒斓捏w細(xì)胞體外分化得到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的工作意義重大且仍需深入。

表1 細(xì)胞分化中所用小分子物質(zhì)及其作用Table 1 Small molecules and their functions during cell differentiation