柴燕濤，姜棋予，馮 帆，孫慧偉，李曉娟，楊銳創(chuàng)，王志杰，李瑞生，侯 俊

(解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039)

肝臟腫瘤(liver cancer)主要分為原發(fā)性肝臟腫瘤和轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤[1-2]，其中原發(fā)性肝臟腫瘤主要是來(lái)源于肝細(xì)胞的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[3-4]；而轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤則是其他臟器來(lái)源的腫瘤細(xì)胞經(jīng)由膽道、血道或淋巴道遷移至肝臟內(nèi)部行成的腫瘤組織，具體包括肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHC)[5]、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal cancer liver metastases)[6]、肺癌肝轉(zhuǎn)移(liver metastases of lung cancer)[7]以及乳腺癌肝轉(zhuǎn)移(breast cancer liver metastases)[8]等。由于目前臨床診療技術(shù)的限制，大多數(shù)肝臟腫瘤患者初診即為進(jìn)展期，其主要特征是腫瘤多發(fā)或彌散的腫瘤病灶[9 -10]?，F(xiàn)有的肝臟腫瘤抗腫瘤藥物的研究模型主要是裸鼠皮下成瘤(subcutaneous tumor)，但存在不足之處，難以直觀反映與模擬進(jìn)展期肝臟腫瘤的特性[11-12]。因此迫切需要新的和有效的動(dòng)物模型以更好地模擬與反映出進(jìn)展期肝臟腫瘤的特點(diǎn)。本研究通過(guò)肝門靜脈注射人肝細(xì)胞癌MHCC97-H、人結(jié)直腸癌SW480、人非小細(xì)胞肺癌A549以及人三陰性乳腺癌MDA-MB-231等細(xì)胞，在免疫缺陷小鼠肝臟原位形成了多發(fā)與彌散腫瘤病灶，成功獲得了進(jìn)展期肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、乳腺癌肝轉(zhuǎn)移以及非小細(xì)胞肺癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，為進(jìn)展期肝臟腫瘤抗腫瘤藥物研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系

MHCC97-H(高侵襲性的人HCC細(xì)胞系)[13-14]、SW480(結(jié)直腸癌細(xì)胞系)[15]、A549(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)[16]以及MDA-MB-231(高侵襲性三陰性乳腺癌細(xì)胞)[17]等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)BALB/c裸小鼠25只，雌性，4～5周齡，體重18～20 g(誤差不得大于10%)，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0002]。其中16只用于MHCC97-H細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)：分為四個(gè)不同濃度組：A：5 × 105個(gè)細(xì)胞/只、B：1 × 105個(gè)細(xì)胞/只、C：5 × 104個(gè)細(xì)胞/只以及D：1 × 104個(gè)細(xì)胞/只，每組4只，每只動(dòng)物注射細(xì)胞懸液的體積為500～600 μL；其余9只分為三組，用于MDA-MB0231、SW480和A549細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)，濃度選擇5 × 105個(gè)細(xì)胞/只，每組3只，每只動(dòng)物注射細(xì)胞懸液的體積為500～600 μL。飼養(yǎng)及無(wú)菌手術(shù)在解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行[SYXK (軍) 2017-0010]。飼養(yǎng)室溫度22℃～23℃，環(huán)境濕度50%，自由進(jìn)食和飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查(項(xiàng)目倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-2017-005)。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶等購(gòu)買自美國(guó)Hyclone公司；異氟烷(isoflurane)購(gòu)買自深圳瑞沃德公司；小動(dòng)物PET/CT實(shí)驗(yàn)使用的核素探針18F-FDG等為北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供。細(xì)胞培養(yǎng)瓶為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)用恒溫培養(yǎng)箱、相差倒置顯微鏡等由本實(shí)驗(yàn)室提供；全套解剖用手術(shù)器械由本實(shí)驗(yàn)室保存；吸入式小動(dòng)物麻醉劑機(jī)、蓋革計(jì)數(shù)器和PET/CT系統(tǒng)由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院科醫(yī)學(xué)科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

MHCC97-H、SW480、MDA-MB-231以及A549等細(xì)胞使用添加10% FBS的DMEM，37℃，5% CO2條件培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)良好，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，備用。

1.3.2 門靜脈注射腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

BALB/c裸小鼠使用異氟烷吸入麻醉。在超凈臺(tái)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小動(dòng)物手術(shù)，術(shù)式為開放性手術(shù)。小鼠胸骨下緣正中處，開一個(gè)1.5 cm的開口。將肝葉輕輕擠出，剝離得到肝門靜脈，使用注射器將不同數(shù)量的不同細(xì)胞經(jīng)由肝門靜脈注射入小鼠肝臟中，在這一過(guò)程中，將細(xì)胞重懸于較大體積(500～600 μL)的生理鹽水中，緩慢推注入肝門靜脈。手術(shù)過(guò)程中，主要進(jìn)行鈍性分離以嚴(yán)格避免小鼠出血；嚴(yán)密觀察小鼠心率等生理狀況。

1.3.3 小動(dòng)物PET/CT檢測(cè)

BALB/c裸小鼠經(jīng)由尾靜脈注射約200 μCi核素探針18F-FDG，30～40 min后對(duì)BALB/c裸小鼠進(jìn)行PET/CT檢測(cè)，按照18F-FDG核素掃描模式，進(jìn)行12 min掃描采像[18-19]。在此基礎(chǔ)上，收集動(dòng)物獲得肝臟組織，利用蓋革計(jì)數(shù)器確定動(dòng)物肝臟于血液的核素強(qiáng)度，同時(shí)收集動(dòng)物肝臟組織拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的病灶

結(jié)果顯示：將不同濃度(A：5 × 105個(gè)細(xì)胞、B：1 × 105個(gè)細(xì)胞、C：5 × 104個(gè)細(xì)胞以及D：1 × 104個(gè)細(xì)胞)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97-H經(jīng)由肝門靜脈注射接種入裸鼠肝臟，經(jīng)過(guò)4～6周生長(zhǎng)后，使用PET/CT進(jìn)行活體成像能夠檢測(cè)小鼠肝臟部位有明確的核素信號(hào)。核素強(qiáng)度、信號(hào)與細(xì)胞接種量有量效關(guān)系(見圖1)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行解剖，剝離肝臟可見其表面已形成明確的多發(fā)、彌散腫瘤病灶，病灶形成的數(shù)量或肝臟病變的程度與肝臟接種MHCC97-H細(xì)胞的數(shù)量具有量效關(guān)系(見圖2)。這表明，經(jīng)由肝門靜脈接種MHCC97-H細(xì)胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶；腫瘤細(xì)胞在肝臟的生長(zhǎng)過(guò)程中，可以使用PET/CT活體成像進(jìn)行追蹤與判別。

注：A～D：分別為經(jīng)門靜脈注入肝臟不同濃度MHCC97-H細(xì)胞后檢測(cè)到明確的核素信號(hào)(A：5 × 105個(gè)細(xì)胞，B：1 × 105個(gè)細(xì)胞，C：5 × 104個(gè)細(xì)胞，D：1 × 104個(gè)細(xì)胞)，白色箭頭所示為動(dòng)物肝臟部位的核素信號(hào)與病變情況；E：蓋革計(jì)數(shù)器對(duì)核素信號(hào)進(jìn)行定量展示。圖1 裸鼠肝臟接種MHCC97-H細(xì)胞后PET/CT檢測(cè)Note. A-D: Clear nuclide signals detected after injecting different concentrations of MHCC97-H cells into the liver via the portal vein (A: 5 × 105 cells; B: 1 × 105 cells; C: 5 × 104 cells; D: 1 × 104 cells). White arrow indicates the PET intensity of mouse liver. E: Quantitative display of the nuclide signal from a Geiger counter.Figure 1 Identification of intrahepatic growth of MHCC97-H cells via PET/CT screening in nude mouse liver

注：第一排：5 × 105個(gè)細(xì)胞；第二排：1 × 105個(gè)細(xì)胞；第三排：5 × 104個(gè)細(xì)胞；第四排：1 × 104個(gè)細(xì)胞。白色箭頭指示動(dòng)物肝臟部位多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。圖2 MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶Note. The first row: 5 × 105 cells; the second row: 1 × 105 cells; the third row: 5 × 104 cells; the fourth row: 1 × 104 cells. White arrow indicates multiple and diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MHCC97-H cells.Figure 2 Multiple and diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MHCC97-H cells

2.2 MDA-MB-231、A549以及SW480以及細(xì)胞癌在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的病灶

結(jié)果顯示：在裸鼠肝臟中經(jīng)由肝門靜脈注射5 × 105個(gè)高侵襲性的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系，經(jīng)4～6周生長(zhǎng)后進(jìn)行PET/CT檢測(cè)，能夠發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟部位有明確的核素信號(hào)(見圖3)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行解剖，剝?nèi)「闻K可見其表面有明確的多發(fā)、彌散腫瘤病灶(見圖4)。這表明，經(jīng)由肝門靜脈接種A549、MDA-MB-231以及SW480細(xì)胞，細(xì)胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶；腫瘤細(xì)胞在肝臟的生長(zhǎng)過(guò)程中，可以使用PET/CT活體成像進(jìn)行追蹤與判別。

注：A：從左向右分別為經(jīng)門靜脈注入肝臟MDA-MB-231、A549、SW480細(xì)胞后檢測(cè)到明確的核素信號(hào)(5 × 105個(gè)細(xì)胞)，白色箭頭指示動(dòng)物肝臟部位的核素信號(hào)與病變情況；B：蓋革計(jì)數(shù)器對(duì)核素信號(hào)進(jìn)行定量展示。圖3 裸鼠肝臟接種MDA-MB-231、A549以及SW480細(xì)胞后PET/CT檢測(cè)Note. A: From left to right, the clear nuclide signals detected after injecting MDA-MB-231, A549, and SW480 cells into the liver through the portal vein (5 × 105 cells). White arrow indicates the PET intensity of mouse liver. B: Quantitative display of the nuclide signal from a Geiger counter.Figure 3 Identification of intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells via PET/CT screening in nude mouse liver

注：第一排：MDA-MB-231細(xì)胞；第二排：A549細(xì)胞；第三排：SW480細(xì)胞。白色箭頭指示動(dòng)物肝臟部位多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。圖4 MDA-MB-231、A549以及SW480細(xì)胞在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶Note. The first row: MDA-MB-231 cells; the second row: A549 cells; the third row: SW480 cells. White arrow indicates the multiple diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells.Figure 4 Multiple diffuse nodules in nude mouse liver formed by the intrahepatic growth of MDA-MB-231, A549, or SW480 cells

3 討論

目前，受限于臨床診療技術(shù)，大多數(shù)肝臟腫瘤患者初診即為進(jìn)展期，失去外科手術(shù)或肝移植等根治性治療的機(jī)會(huì)[20]。進(jìn)展期肝臟腫瘤的主要特征是腫瘤細(xì)胞形成多發(fā)或彌散的腫瘤病灶，并可能伴隨有血管侵犯等[9-10]。藥物治療在進(jìn)展期肝臟腫瘤綜合治療中具有重要意義，但現(xiàn)有的肝臟腫瘤抗腫瘤藥物的研究模型不足，難以直觀反映與模擬進(jìn)展期肝臟腫瘤的特性。這體現(xiàn)在：①裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)雖然是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但其與肝臟原位的腫瘤病灶有較大差別；②在肝臟接種組織微塊或定點(diǎn)注射腫瘤細(xì)胞僅能夠形成單一病灶，難以形成多發(fā)和彌散的腫瘤病灶；③現(xiàn)有常用的腫瘤轉(zhuǎn)移或侵襲模型，主要是通過(guò)尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞懸液，以此在裸鼠中接種腫瘤細(xì)胞，但此時(shí)細(xì)胞迅速經(jīng)由尾靜脈-下腔靜脈回心，進(jìn)而通過(guò)肺動(dòng)脈主要分布于肺部。為解決這些問題，本研究利用肝門靜脈注射的方法，將腫瘤細(xì)胞經(jīng)由肝門靜脈接種于裸鼠肝臟，最終在肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。這不僅實(shí)現(xiàn)了利用高侵襲性的MHCC97-H細(xì)胞形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶以模擬進(jìn)展期肝細(xì)胞癌，也通過(guò)SW480、A549與MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌與乳腺癌肝轉(zhuǎn)移。

尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞經(jīng)由下腔靜脈回心進(jìn)而留駐于肺臟的組織間隙。與之類似的，經(jīng)由肝門靜脈將腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)入肝臟，腫瘤細(xì)胞也能夠留駐在肝臟組織間隙。受到毛細(xì)血管分布、血流等因素的影響，加之小鼠肝臟較薄，腫瘤細(xì)胞主要是在小鼠肝臟的表面或淺表部位形成多發(fā)與彌散的腫瘤組織。此外，肝臟血流充沛，有肝門靜脈與肝動(dòng)脈雙重供血，與肺臟相比腫瘤細(xì)胞不易形成肝臟組織局部栓塞，因此尤其適合于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與形成病灶。在手術(shù)中，本課題組對(duì)全套手術(shù)器械進(jìn)行高壓滅菌，全程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行手術(shù)操作，能夠有效避免感染；同時(shí)在消化細(xì)胞時(shí)(收集與獲得培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞)盡可能充分消化細(xì)胞以避免細(xì)胞團(tuán)塊的存在帶來(lái)栓塞的風(fēng)險(xiǎn)；利用較大體積的生理鹽水重懸細(xì)胞后，緩慢推注進(jìn)入肝門靜脈，同時(shí)不斷觀察小鼠心率變化；在手術(shù)后，將小鼠分籠飼養(yǎng)以避免縫合后的創(chuàng)口的抓傷或撕咬。這些措施可使得動(dòng)物存活率與造模成功率維持在較高水平。

小動(dòng)物PET是前沿與先進(jìn)的活體成像、分子影像技術(shù)，能夠通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織、細(xì)胞對(duì)18F核素取代葡萄糖分子探針(18F-FDG)的攝取，對(duì)裸鼠肝臟腫瘤組織進(jìn)行活體成像[21]。惡性腫瘤細(xì)胞具有旺盛的增殖能力，其對(duì)葡萄糖的攝取遠(yuǎn)強(qiáng)于正常組織或器官。在此基礎(chǔ)上，肝臟是人體物質(zhì)與能量代謝的中心器官，來(lái)源于肝細(xì)胞的肝細(xì)胞癌具有比其他惡性腫瘤或正常組織器官更為強(qiáng)烈的對(duì)葡萄糖的攝取作用，這使得采用PET掃描能夠特異性與有效地識(shí)別和確證腫瘤組織。在實(shí)驗(yàn)中，本課題組在肝門靜脈注射腫瘤細(xì)胞后能夠利用小動(dòng)物PET實(shí)現(xiàn)對(duì)裸鼠的活體成像，對(duì)細(xì)胞在肝臟中的生長(zhǎng)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)與活體檢測(cè)。裸鼠經(jīng)過(guò)PET活體成像后收集動(dòng)物肝臟發(fā)現(xiàn)，MHCC97-H細(xì)胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的的病灶(nodules)，為利用動(dòng)物模型模擬進(jìn)展期肝細(xì)胞癌以及相關(guān)抗腫瘤、抗腫瘤藥物研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

除MHCC97-H細(xì)胞外，本課題組還通過(guò)肝門靜脈注射人三陰性乳腺癌MDA-MB-231、人非小細(xì)胞肺癌A549以及人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，也在免疫缺陷小鼠肝臟原位形成了多發(fā)與彌散腫瘤病灶。肝臟是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的重要器官，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌以及肺癌等都能夠肝轉(zhuǎn)移[22-24]。在研究中，A549是非小細(xì)胞肺癌中腺癌亞型的細(xì)胞系，代表了肺癌最為主要的病理類型；SW480細(xì)胞是一種結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移病灶來(lái)源的細(xì)胞系，是研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的理想模型；MDA-MB-231細(xì)胞是三陰性乳腺癌細(xì)胞系，具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移與侵襲能力。MDA-MB-231、A549以及SW480細(xì)胞都能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)上述動(dòng)物模型進(jìn)行活體成像，接種MDA-MB-231、A549以及SW480細(xì)胞的裸鼠，其肝臟部位能夠?yàn)?8F-FDG核素探針?biāo)R(shí)別。這表明，本研究不僅建立了結(jié)直腸癌、乳腺癌與非小細(xì)胞肺癌的肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，也能夠利用小動(dòng)物PET等分子影像技術(shù)進(jìn)行活體成像，動(dòng)態(tài)跟蹤腫瘤細(xì)胞在裸鼠肝臟的生長(zhǎng)。