張 娟，王立群,2，周月希,2，刁 波，周 蓉，解 迪

(1.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，武漢 430070； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430070； 3.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女中最常見的內(nèi)分泌失調(diào)性疾病之一，臨床上主要以以下三種表現(xiàn)為特征：稀發(fā)排卵或者無排卵、高雄激素的臨床或生化表現(xiàn)以及卵巢多囊改變。PCOS是引起無排卵性不孕的主要原因，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。在PCOS患者雙側(cè)卵巢中，可見多個囊性擴(kuò)張的卵泡，而少有優(yōu)勢卵泡形成，這說明在PCOS患者的卵巢中，卵泡的發(fā)育過程存在著障礙。

大量研究表明，顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞的成熟和卵泡的發(fā)育過程中起到重要作用，在卵泡選擇閉鎖的過程中，顆粒細(xì)胞是最早經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞群[1]，目前已知的細(xì)胞凋亡途徑主要為兩種，一種是由死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑，一種是由線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，許多學(xué)者認(rèn)為，在卵泡顆粒細(xì)胞選擇性凋亡的過程中，死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮了重要作用[2]，其中，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)及其受體系統(tǒng)已經(jīng)被證實(shí)在顆粒細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要作用[8-11]，但它們在PCOS卵泡發(fā)育中的作用鮮有報(bào)道。本課題組前期的研究表明TRAIL及其受體——死亡受體-4(death receptor-4，DR4)和誘騙受體-1(decoy receptor-1，DcR1)在PCOS大鼠竇狀卵泡顆粒細(xì)胞中有異常表達(dá)[3]，提示TRAIL、DR4和DcR1的表達(dá)變化可能對PCOS卵泡的異常發(fā)育起到了一定作用，但是TRAIL另外兩個受體——死亡受體-5(death receptor-5，DR5)、誘騙受體-2(decoy receptor-2，DcR2)的表達(dá)變化及其表達(dá)意義尚不清楚。

因此，筆者在本次研究中先采用皮下注射硫酸普拉睪酮鈉(脫氫表雄酮硫酸鈉鹽制劑)來構(gòu)建PCOS大鼠模型，然后分別用免疫組織化學(xué)染色、RT-qPCR分析觀察并比較DR5、DcR2在PCOS組和對照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)情況，綜合前期的研究結(jié)果，來全面探討TRAIL及其受體系統(tǒng)在PCOS大鼠卵泡發(fā)育中可能發(fā)揮的作用，從而更深入地了解PCOS卵泡發(fā)育障礙的可能機(jī)制，為PCOS卵泡發(fā)育障礙的治療提供一個新的想法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性SD大鼠20只，SPF級，體重50～60 g，21日齡，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供[SCXX (鄂) 2015-0018]，在湖北省疾病預(yù)防控制中心SPF級屏障環(huán)境[SYXK (鄂) 2017-0065]中飼養(yǎng)，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度為50%～60%，自由飲食，光照周期為日夜各12 h。所有動物均為麻醉后處死。本次動物實(shí)驗(yàn)得到廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會的許可(編號：20170238)，在實(shí)驗(yàn)過程中，遵循實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

硫酸普拉睪酮鈉，青島捷世康生物科技有限公司；注射用水，浙江瑞新藥廠；TRIzol試劑盒，美國Invitrogene公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Invitrogene公司；SYBR Green PCR試劑盒，美國Thermo Fisher公司；兔抗大鼠DR5、DcR2多克隆抗體，Abcam公司。PL303型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；L600型離心機(jī)，湘儀儀器廠；YD6L生物組織包埋機(jī)，金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；RM2016輪轉(zhuǎn)型切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；BX51奧林巴斯熒光顯微鏡，日本Olympus公司；PTC-100TM全自動PCR儀，美國Bio-Rad公司；752-P紫外分光光度計(jì)，上?，F(xiàn)科儀器有限公司；LC96熒光定量PCR儀，美國Roche公司；AJC-0501-P純水蒸餾器，重慶艾科普；東方A型恒溫烤箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；各種微量移液器，上海安亭科學(xué)儀器廠；醫(yī)用手術(shù)器械，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型的建立[4]

21日齡雌性SD大鼠，斷乳，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天，23日齡時隨機(jī)分為兩組，每組10只。其中一組大鼠每日按硫酸普拉睪酮鈉90 mg/g行皮下注射，相當(dāng)于DHEA(脫氫表雄酮)60 mg/g，0.4 mL注射用水溶解，連續(xù)注射20 d，用來建立PCOS大鼠模型，該組設(shè)為PCOS組。另一組設(shè)為對照組，每日皮下注射0.4 mL注射用水，連續(xù)注射20 d。所有大鼠于注射后第21天的早晨用4%水合氯醛麻醉，解剖取卵巢，分離表面多余組織，固定(4%多聚甲醛)，石蠟包埋，制備4 μm厚切片，行HE染色和免疫組化染色。

1.3.2 卵泡發(fā)育級別判斷

始基卵泡：初級卵母細(xì)胞停留于減數(shù)分裂雙線期，其周圍圍繞了一層梭形前顆粒細(xì)胞。

竇前卵泡：初級卵母細(xì)胞增大，其周圍圍繞了數(shù)層立方形顆粒細(xì)胞。

竇狀卵泡：卵泡內(nèi)形成卵泡腔，由增加的卵泡液融合而成，卵母細(xì)胞被卵泡腔所圍繞，顆粒細(xì)胞被分為圍繞在卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞和位于卵泡外周的基底膜顆粒細(xì)胞。此時卵泡直徑可增大至500 μm。

1.3.3 卵巢HE染色

卵巢石蠟切片(4 μm)脫蠟至水，蘇木素染色1.5 min，自來水洗返藍(lán)，顯微鏡下觀察核藍(lán)紫色，100%乙醇浸泡3 min，伊紅染色10 s，100%乙醇浸泡10 s，觀察細(xì)胞質(zhì)紅色，晾干，中性樹脂封片。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色檢測DR5、DcR2蛋白的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物)法：大鼠卵巢石蠟切片，脫蠟至水，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加一抗(用PBS按1∶200稀釋的兔抗大鼠DR5抗體和按1∶100稀釋的兔抗大鼠DcR2抗體)，以PBS替代一抗作陰性對照，4℃過夜；加二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，用PBS按1∶200稀釋)，37℃孵育35 min；加SABC(用PBS按1∶200稀釋)，37℃孵育30 min；DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間(5～10 min)；自來水洗后蘇木素復(fù)染，晾干，中性樹膠封片。采用日本奧林巴斯BX51熒光顯微鏡成像，高倍視野(× 400)下，觀察各級卵泡顆粒細(xì)胞DR5、DcR2蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞被染成棕黃色，由Image-Pro Plus計(jì)算顆粒細(xì)胞內(nèi)棕黃色區(qū)域面積(Area)及光密度值(IOD)，平均光密度值(OD)為兩者之比(IOD/Area)，棕黃色著色越深，對應(yīng)的OD值越大，蛋白表達(dá)越強(qiáng)，反之則反。

1.3.5 RT-qPCR法檢測卵巢顆粒細(xì)胞的DR5和DcR2基因的表達(dá)

將上述摘取的卵巢，置于培養(yǎng)皿中，分離掉表面多余的脂肪組織，用1 mL注射器針頭劃破卵巢，用0.01 mol/L PBS反復(fù)沖洗卵泡，以充分釋放顆粒細(xì)胞，將含顆粒細(xì)胞的PBS吸取至離心管中，2000 r/min離心10 min，丟棄上清，用PBS將顆粒細(xì)胞重懸，再將懸液移至45% Percoll液之上，2000 r/min離心10 min，顆粒細(xì)胞位于上層[3]，將顆粒細(xì)胞移至TRIzol液中，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min)，然后按照SYBR Green PCR試劑盒說明書要求進(jìn)行RT-qPCR(反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)處理3 min；95℃ 3 s，60℃ 10 s，共40個循環(huán)；最后95℃ 10 s，65℃ 10 s，97℃ 1 s。反應(yīng)系統(tǒng)為Light Cycler 96系統(tǒng))。各種引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 卵巢光鏡HE染色檢查

如圖所示，PCOS組大鼠卵巢切面沿包膜下可見多個卵泡呈囊性擴(kuò)張，黃體形成明顯減少，囊性擴(kuò)張的卵泡內(nèi)不見卵母細(xì)胞或放射冠，卵泡周圍顆粒細(xì)胞排列松散，層數(shù)變薄甚至消失，而卵泡膜細(xì)胞有增生(圖1A)。而對照組大鼠卵巢切面可以看見許多處于不同發(fā)育時期的卵泡，并有多個黃體形成，成熟的卵泡內(nèi)可見卵母細(xì)胞及放射冠，其周圍顆粒細(xì)胞排列整齊，層數(shù)較厚，可達(dá)8～9層(圖1B)。

2.2 DR5在卵巢各級卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)

DR5的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜的棕黃色染色。DR5在PCOS組和對照組大鼠各級卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有陽性表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，DR5在PCOS組大鼠卵巢各級卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)較對照組同級卵泡均明顯增強(qiáng)，且多表達(dá)于PCOS組竇狀卵泡的卵泡壁內(nèi)層顆粒細(xì)胞(表2，圖2)。

2.3 DcR2在卵巢各級卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)

DcR2陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜的棕黃色染色。DcR2在PCOS組和對照組大鼠各級卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均有陽性表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，DcR2在兩組大鼠始基卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)差異無顯著性，而在PCOS組竇前卵泡和竇狀卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)較對照組同級別卵泡明顯增強(qiáng)，且多表達(dá)于PCOS組竇狀卵泡的卵泡壁內(nèi)層顆粒細(xì)胞(表3，圖3)。

注：A：PCOS組；B：對照組。圖1 大鼠卵巢(HE染色，× 100)Note. A: PCOS group; B: Control group.Figure 1 Rat ovary. HE staining

組別Groups始基卵泡Primordial follicles竇前卵泡Preantral follicles竇狀卵泡Antral follicles對照組Control group0.1035±0.0036 (30)0.1177±0.0125 (29)0.1267±0.0115 (27)PCOS組PCOS group0.1466±0.0038* (29)0.1768±0.0160* (28)0.1944±0.0148* (26)

注：括號內(nèi)為卵泡個數(shù)。與對照組同級別卵泡相比，*P< 0.05。

Note. The number of follicles is shown in parentheses. Compared with follicles at the same level in the control group,*P< 0.05.

注：A～C：分別為PCOS組大鼠卵巢始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡；D～F：分別為對照組大鼠卵巢始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡。圖2 DR5在大鼠卵巢各級別卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)(SABC法，× 400)Note. A-C: The primordial follicle, preantral follicle, and antral follicle in rat ovary of the PCOS group, respectively. D-F: The primordial follicle, preantral follicle, and antral follicle in rat ovary of the control group, respectively.Figure 2 DR5 expression in different levels of follicle granulosa cells in rat ovary. SABC method

組別Groups始基卵泡Primordial follicles竇前卵泡Preantral follicles竇狀卵泡Antral follicles對照組Control group0.0570±0.0051 (30)0.0543±0.0025 (29)0.0620±0.0057 (27)PCOS組PCOS group0.0579±0.0039 (29)0.0829±0.0023* (28)0.1569±0.0124* (26)

注：括號內(nèi)為卵泡個數(shù)。與對照組同級別卵泡比較，*P< 0.05。

Note. The number of follicles is shown in parentheses. Compared with follicles at the same level in the control group,*P< 0.05.

注：A～C：分別為PCOS組大鼠卵巢始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡；D～F：分別為對照組大鼠卵巢始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡。圖3 大鼠卵巢各級別卵泡顆粒細(xì)胞DcR2表達(dá)(SABC法，× 400)Note. A-C: The primordial follicle, preantral follicle, and antral follicle in rat ovary of the PCOS group, respectively. D-F: The primordial follicle, preantral follicle, and antral follicle in rat ovary of the control group.Figure 3 DcR2 expression in different levels of follicle granulosa cells in rat ovary. SABC method

2.5 顆粒細(xì)胞中DR5 mRNA及DcR2 mRNA的表達(dá)

RT-qPCR顯示，DR5 mRNA和DcR2 mRNA在兩組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者在PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)較正常對照組均明顯增強(qiáng)(P< 0.05)。詳見圖4。

注：與對照組相比，* P< 0.05。圖4 PCOS組和對照組顆粒細(xì)胞DR5 mRNA和DcR2 mRNA相對表達(dá)量Note. Compared with the control group,* P< 0.05.Figure 4 Relative expression of DR5 mRNA and DcR2 mRNA in granulosa cells of PCOS group and control group

3 討論

在PCOS患者雙側(cè)卵巢中，可見多個囊性擴(kuò)張的卵泡，它們既不閉鎖也無法形成優(yōu)勢卵泡，這提示在PCOS患者卵巢中，卵泡的發(fā)育存在著障礙。卵泡中卵母細(xì)胞的正常發(fā)育不僅與促性腺激素的調(diào)節(jié)有關(guān)，還與顆粒細(xì)胞及膜細(xì)胞之間的聯(lián)系密切相關(guān)[5]。顆粒細(xì)胞是卵泡里最大的細(xì)胞群，是最靠近卵母細(xì)胞的體細(xì)胞，大量研究表明，顆粒細(xì)胞在卵泡的發(fā)育過程中起到重要作用，在卵泡選擇閉鎖的過程中，顆粒細(xì)胞是最早經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞群[1]。

目前已知細(xì)胞的凋亡途徑主要為兩種，一種是由死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑，一種是由線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。許多學(xué)者認(rèn)為，由死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑在卵泡顆粒細(xì)胞選擇性凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[2]。Wada等[8-10]研究表明TRAIL及其受體系統(tǒng)在豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。J??skel?inen等[11]研究了人不同時期卵巢TRAIL及其受體表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DcR1在成人期卵巢顆粒細(xì)胞中有表達(dá)而不表達(dá)于胎兒期卵巢顆粒細(xì)胞，TRAIL、DR5、DcR2在成人期卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)較胎兒期是明顯增強(qiáng)的，而從胎兒期到成人期這個過程中，卵泡的數(shù)量是通過閉鎖、退化而不斷減少的，提示TRAIL及其受體系統(tǒng)可能協(xié)同調(diào)控著人卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程。但是TRAIL及其受體系統(tǒng)在PCOS卵泡發(fā)育過程中的作用卻鮮有報(bào)道。

Mikaeili等[6]通過對比PCOS患者和輸卵管堵塞育齡期婦女卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，PCOS患者顆粒細(xì)胞凋亡是明顯增加的，本課題組前期的研究也表明，在PCOS大鼠卵泡發(fā)育過程中，竇狀卵泡顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率較對照組明顯升高[7]，同時本課題組還發(fā)現(xiàn)TRAIL及其受體DR4和DcR1在PCOS各級卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)是有異常的[3]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，PCOS組各級卵泡顆粒細(xì)胞中DR5和DcR2表達(dá)是有異常的：在始基卵泡中，DR5表達(dá)增強(qiáng)，DcR2表達(dá)無明顯差異，在竇前卵泡和竇狀卵泡中，DR5、DcR2的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。在這三個級別的卵泡中，只有竇狀卵泡顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯升高[7]，由于TRAIL與死亡受體結(jié)合會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與誘騙受體結(jié)合無法將凋亡信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)而無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，因此本課題組推測：在正常卵泡顆粒細(xì)胞中，TRAIL與不同受體結(jié)合后在誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡之間可能存在著一種精妙的平衡，但是在PCOS竇狀卵泡顆粒細(xì)胞中，由于TRAIL及其受體系統(tǒng)的表達(dá)均發(fā)生了比較大的變化，這種精妙的平衡被打破，由TRAIL參與的顆粒細(xì)胞自我穩(wěn)定環(huán)境消失，這可能是PCOS竇狀卵泡顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率升高的原因之一。

在PCOS竇狀卵泡顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率升高的同時，DcR2的表達(dá)也是明顯增強(qiáng)的，但是由于DcR2缺少完整的死亡結(jié)構(gòu)域，它與TRAIL結(jié)合不僅不誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，還可與死亡受體競爭結(jié)合TRAIL，從而起到保護(hù)靶細(xì)胞的作用，這提示在PCOS大鼠竇狀卵泡中，DcR2陽性的顆粒細(xì)胞可能發(fā)揮著凋亡抵抗的作用。有研究表明，DcR2在衰老的腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中有高表達(dá)[14]，它在缺血再灌注后大鼠腎組織的表達(dá)量明顯升高，與腎功能及腎組織損傷程度明顯正相關(guān)[15]，那么PCOS大鼠卵泡顆粒細(xì)胞上DcR2的表達(dá)量與顆粒細(xì)胞凋亡程度是否也有一定的相關(guān)性，目前未見報(bào)道，這有待于本課題組進(jìn)一步的研究。本次研究結(jié)果還表明DR5和DcR2多表達(dá)于PCOS組大鼠卵巢竇狀卵泡的內(nèi)層顆粒細(xì)胞，本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)凋亡也多發(fā)生于PCOS組大鼠卵巢竇狀卵泡的內(nèi)層顆粒細(xì)胞[7]，提示PCOS組竇狀卵泡內(nèi)層顆粒細(xì)胞中DR5和DcR2的異常表達(dá)，可能是導(dǎo)致卵泡內(nèi)層顆粒細(xì)胞凋亡增多的原因之一，而Okutsu等[13]提出，處于發(fā)育后期卵泡的卵泡壁內(nèi)層顆粒細(xì)胞的凋亡增加，可能是導(dǎo)致卵泡囊性擴(kuò)張的主要原因，提示PCOS組竇狀卵泡內(nèi)層顆粒細(xì)胞中DR5和DcR2的異常表達(dá)，可能對PCOS卵泡的異常發(fā)育起到了一定作用。

綜上所述，DR5和DcR2在顆粒細(xì)胞中的異常表達(dá)可能對PCOS大鼠卵泡的異常發(fā)育起到了一定作用，它們可能是通過參與顆粒細(xì)胞的凋亡過程而對PCOS卵泡的發(fā)育造成了一定影響，這為日后PCOS卵泡發(fā)育障礙的治療提供了一個新思路。