邢玉潔，朱火蘭，朱舜明，張榮懷，崔倩衛(wèi)，劉小祥，王軍奎

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科(西安 710068)

主題詞 血管緊張素Ⅱ @心肌樣細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 動物，實驗 大鼠

缺血性心臟病是一種對人類健康能夠造成嚴(yán)重危害的疾病，目前的發(fā)病率也在不斷的增加[1]。面對藥物治療的局限性，近年來興起的細(xì)胞移植術(shù)為治療缺血性心臟病帶來了希望，這項技術(shù)的應(yīng)用能夠使壞死的心肌得以修復(fù)，提高心臟功能[2]。目前，這項技術(shù)多選用各種干細(xì)胞，而BMMSCs是其中研究比較廣泛的一種干細(xì)胞[3-4], 有相關(guān)報道指出血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)在誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌細(xì)胞的過程中占據(jù)十分重要的作用[5]。本實驗擬觀察血管緊張素Ⅱ?qū)Υ笫驜MMSCs向心肌細(xì)胞分化的可行性及有效性。

材料和方法

1 主要實驗試劑和實驗動物 AngⅡ ( Sigma, USA), Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液(1.077 g/ml, TBD公司)，胎牛血清(Gibco, USA), MTT (Sigma，USA)，L-DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone, USA)，胰蛋白酶(Sigma, USA)，Hoechst 33258 (Sigma, USA)。4周齡、質(zhì)量約為80～100 g的健康雄性SD大鼠，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

2 實驗方法

2.1 BMMSCs的分離與培養(yǎng)：SD大鼠斷頸處死后取雙下肢長骨，在培養(yǎng)皿中將股骨、脛骨分別分離出來，然后酒精(75%)消毒5 min。消毒結(jié)束后，用培養(yǎng)液多次沖洗股骨、脛骨的骨髓腔，收集沖洗液，然后加入淋巴細(xì)胞分離液(1.077 g/ml)，開始離心(2000 r/min，20 min)。離心完畢后，可以看到分為三層，用吸管將中間云霧狀的有核細(xì)胞層吸出,然后加入不完全培養(yǎng)液進(jìn)行離心(1500 r/min，10 min)，之后用完全培養(yǎng)液重懸后于25 cm2的培養(yǎng)瓶中接種, 最后置于5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。隔3 d換1次液，到80%細(xì)胞聚集時，按照1∶2比例傳代，傳到第3代備用。

2.2 BMMSCs的誘導(dǎo)分化：選用第3代BMMSCs，對照組只加入基本的培養(yǎng)基，試驗組加入AngⅡ (0.1μmol/L) 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)24 h后，用吸管將誘導(dǎo)液輕輕的吸棄，然后分別添加完全的培養(yǎng)基，3 d換液1次，共培養(yǎng)4周。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定：在BMMSCs的分離培養(yǎng)及Ang Ⅱ誘導(dǎo)前后，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行密切觀察，重點記錄細(xì)胞的生長及形態(tài)學(xué)的改變。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞活性并描繪細(xì)胞增殖曲線：將第三代BMMSCs以1×105/ml接種于24孔板中，分為兩組，每組12孔，每孔接種細(xì)胞懸液200 μl。培養(yǎng)24 h之后進(jìn)行誘導(dǎo)，試驗組加入含Ang Ⅱ 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對照組只加入基本的培養(yǎng)基。于1、3、5、7 d在每孔加入MTT溶液20 μl (濃度5 mg/ ml)，孵育4 h后吸棄各孔內(nèi)的上清液，然后加入DMSO150 μl，振蕩10 min，最后在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm的波長進(jìn)行比色，測定各孔的光吸收值(A)，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制增殖曲線。

2.5 免疫熒光染色：將誘導(dǎo)4 周后的細(xì)胞進(jìn)行爬片，4%多聚甲醛固定，山羊血清封閉30 min，cTnI抗體4 ℃過夜，然后加入二抗(FITC標(biāo)記)避光染色40 min，最后用Hoechst 33258孵育10 min，甘油封片后熒光顯微鏡下拍照。

2.6 流式細(xì)胞檢測：調(diào)整誘導(dǎo)4 w后的細(xì)胞密度達(dá)到1×106個/ml, 加入cTnI抗體染色1h，再加入二抗避光染色40 min，然后40 g/L多聚甲醛固定20 min，最后流式細(xì)胞儀檢測，計算染色陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率。

2.7 透射電鏡：離心使誘導(dǎo)4w后的細(xì)胞成團(tuán)，于4 ℃用3%戊二醛前固定2 h，再進(jìn)行后固定(1%四氧化鋨，2 h)，然后依次進(jìn)行漂洗、梯度脫水、包埋(按照環(huán)氧丙烷∶包埋劑=1∶1比例配置)、切片和鉛鈾染色，并于透射電鏡下拍照。

結(jié) 果

1 BMMSCs的形態(tài)學(xué)變化 BMMSCs原代培養(yǎng)后具有較強(qiáng)的折光性，形狀為圓形 (圖1A)。培養(yǎng)3天后形態(tài)呈多樣化，可見短紡錘形，也可見三角形的、星形的或是扇形的(圖1B)。與原代細(xì)胞相比，傳代后細(xì)胞的體積增大，大多數(shù)呈梭形, 偶有一些呈多角形或三角形(圖 1C)。經(jīng)過Ang Ⅱ誘導(dǎo)后，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積逐漸增大，4周以后細(xì)胞形狀變?yōu)殚L梭形，而且排列均一、整齊(圖 1D)。

A : 初次分離的BMMSCs (×100倍); B:原代培養(yǎng)第3d的BMMSCs(×100倍);C:傳代培養(yǎng)的BMMSCs(×200倍); D: Ang Ⅱ誘導(dǎo)4周的BMMSCs沿細(xì)胞長軸呈一致性排列(×400倍)

圖1 AngⅡ誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

不同時間段細(xì)胞形態(tài)的變化

2 細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果 MTT法檢測結(jié)果顯示：在第3d兩組細(xì)胞的增殖能力被抑制，此后再逐漸變強(qiáng)(圖2)。且AngⅡ組細(xì)胞的增殖能力較對照組明顯增強(qiáng)。

圖2 細(xì)胞的增殖曲線

3 免疫熒光染色結(jié)果 經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的BMMSCs第4周陽性表達(dá)cTnI, 細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，而細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(圖3)。而對照組的細(xì)胞cTnI為陰性表達(dá)。

A：被AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)cTnI，呈綠色熒光(×200)；B：細(xì)胞核被Hoechst33258染色，呈藍(lán)色熒光(×200)；C：圖A與圖B合并后呈圖C(×200)

圖3 AngⅡ誘導(dǎo)4周后cTnI熒光染色

4 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示：在對照組中FITC陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù) (1.0±0.2) %，在AngⅡ組中 FITC陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù) (25.3±2.2) %。AngⅡ組心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化率較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05圖4 經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)4周后細(xì)胞誘導(dǎo)分化率檢測結(jié)果

5 透射電鏡結(jié)果 透射電鏡結(jié)果示：經(jīng)過AngⅡ誘導(dǎo)的BMMSCs細(xì)胞器聚集在核周圍，含有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，還有Z線樣物質(zhì)、肌絲 (圖5)。而對照組未見Z線樣物質(zhì)和肌絲。

注：細(xì)箭頭所示為肌絲，粗箭頭所示為Z線樣物質(zhì)圖5 透射電鏡檢測結(jié)果(×80K)

討 論

眾所周知，5-氮雜胞苷可誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞[6]，然而其本身具有一定的毒性，誘導(dǎo)率也不是很高，所以臨床有效性和安全性不是十分明確。因此，目前迫切需要尋找一種藥物，既具有安全性又具有有效性，而且還要有較高的誘導(dǎo)分化率。有學(xué)者指出，Ang Ⅱ可在體外誘導(dǎo)人BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，但此方面的研究相對較少，且其具體的誘導(dǎo)分化有效性也不十分明確。

AngⅡ?qū)儆陔念惣に?，也是一種生長因子，具有調(diào)節(jié)血管張力和水鈉代謝的作用，還可以刺激成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖。研究表明：AngⅡ是血管平滑肌細(xì)胞強(qiáng)大的絲裂原，能夠通過旁分泌或自分泌方式去刺激血管平滑肌細(xì)胞，使其蛋白質(zhì)和DNA的合成增加，進(jìn)而使細(xì)胞的數(shù)目增多[7]。此外，在堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血小板衍生生長因子的合成與釋放中，AngⅡ發(fā)揮促進(jìn)作用，最終可引起血管平滑肌細(xì)胞分裂和增殖增加[8-9]。因此，本實驗選擇 Ang Ⅱ作為誘導(dǎo)劑，期望能夠促進(jìn)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞。通過MTT檢測示，AngⅡ組細(xì)胞的增殖能力優(yōu)于對照組，表明AngⅡ可以誘導(dǎo)且促進(jìn)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞的增殖與分化。

肌鈣蛋白(Troponin, Tn)一般位于收縮蛋白的細(xì)肌絲上，它是一種調(diào)節(jié)肌肉組織收縮的蛋白，包括TnI、TnT和TnC三個亞單位。cTnI是一種心肌特異性蛋白，對于鑒定心肌細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性。在我們的研究中，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在Ang Ⅱ誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnI表達(dá)陽性, 而在對照組cTnI表達(dá)則呈陰性，這表明我們通過Ang Ⅱ誘導(dǎo)的BMMSCs包含了心肌特異性蛋白。

此外，我們通過MTT檢測顯示：AngⅡ組細(xì)胞的增殖能力顯著高于對照組。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：AngⅡ組心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化率顯著高于對照組[(25.3±2.2)% vs (1.0±0.2)%]。且AngⅡ誘導(dǎo)后的細(xì)胞可見肌絲、Z線樣物質(zhì),符合心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果均說明我們成功用AngⅡ誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，且誘導(dǎo)分化率較高。

盡管取得了以上結(jié)果，但Ang Ⅱ的作用機(jī)制仍然不是很明朗[10-11]。包括 Ang Ⅱ在內(nèi)的多種細(xì)胞因子與其相應(yīng)受體結(jié)合，導(dǎo)致ERK信號通路被激活，進(jìn)一步增加了一些早期的即刻基因如erl-1、c-fos、c-jun等表達(dá)[12]。也有觀點認(rèn)為，細(xì)胞TGF-β1基因和TGF-β受體基因的表達(dá)能夠被Ang Ⅱ增強(qiáng)[13], 而MAPK、PKA以及PKC等細(xì)胞信號通路又可因TGF-β基因表達(dá)增強(qiáng)而被激活。此外，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的水解也與Ang Ⅱ激活磷脂酶C有關(guān)，最終生成二酰甘油 (Diacyl glycerol , DG)與肌醇1 ,4 ,5-三磷酸 (Inositol trisphosphate , IP3 )[14]，這兩者作為第二信使進(jìn)一步激動兩條信號通路：即IP3/Ca2+及DG/PKC信號通路，參與調(diào)節(jié)一些生理過程。因此，AngⅡ誘導(dǎo) BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞可能與其能夠使多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以活化有關(guān)，也或許與其分泌一些誘導(dǎo)因子有關(guān), 但是確切的機(jī)制尚需深入探討。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，分化的細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的特性，且誘導(dǎo)分化率高。這為推動應(yīng)用BMMSCs治療心力衰竭等心血管疾病提供了一種新的策略。