朱婷婷，王玉軍，周東美，施維林，黨 菲

（1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室，南京210008）

銻（Sb）是人體和植物的非必需元素，具有潛在的慢性毒性和致癌性[1]。Sb會抑制植物發(fā)芽和生長，抑制光合作用，影響膜結(jié)構(gòu)和通透性[2]。Sb通過呼吸、飲食或皮膚等暴露途徑進(jìn)入人體后，不僅干擾體內(nèi)糖與蛋白質(zhì)的代謝，損害心臟、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)，還會對黏膜產(chǎn)生刺激作用[3]。由于Sb具有較好的阻燃性，能增加子彈的硬度等特性，廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，人類對Sb的需求量越來越大，使得Sb礦的開采等活動急速增加。我國是世界上最大的Sb資源大國，儲存量和產(chǎn)量均居于世界首位，且多年Sb產(chǎn)量達(dá)到世界總產(chǎn)量的80%[4]。近年來，隨著含Sb礦產(chǎn)的大量開采，Sb礦周邊土壤受到嚴(yán)重污染。Sb環(huán)境污染問題已經(jīng)引起廣泛的重視，目前國內(nèi)外對Sb的生態(tài)毒理研究主要集中在植物、藻類對Sb的吸收[5]和積累過程[6-7]以及Sb對植物、藻類光合作用的脅迫[8]等，總體來說研究比較散，不夠系統(tǒng)，由于缺乏系統(tǒng)性的生態(tài)毒性閾值研究，迄今為止，我國還未頒布關(guān)于Sb的土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，因此開展Sb生態(tài)毒性和閾值研究就顯得尤為重要。

水稻是中國乃至亞洲的主要糧食作物之一，世界上有90%的水稻產(chǎn)于亞洲。我國是水稻生產(chǎn)消費大國，大約有65%的人是以水稻為主食[9]，南方Sb礦周邊種植大量的水稻，對水稻生長造成一定的污染，湖南省Sb礦山附近的水稻土中檢測到Sb的含量是1565 mg·kg-1[10]，是WHO推薦的土壤Sb污染最大允許濃度36 mg·kg-1的43倍，水稻植株的根和種子積累分別高達(dá)225 mg·kg-1和5.79 mg·kg-1[11]。根伸長抑制率是評價重金屬生態(tài)毒性的一個重要指標(biāo)[12-13]。本研究選取全國各地、各種類型的水稻作為研究對象，研究不同品種水稻對Sb脅迫的響應(yīng)差異，以根伸長半抑制最大效應(yīng)濃度（Concentration for 50%of maximal effect，EC50）作為主要參考，對比水稻根部Sb的吸收，及SOD酶和MDA等生理生化指標(biāo)，比較不同品種水稻對Sb的敏感性，初步探究Sb致毒機(jī)理，為污染地區(qū)種植水稻品種的選擇提供依據(jù)；同時為開展Sb毒性閾值和生態(tài)毒性研究及我國Sb標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）水稻品種：供試水稻品種共44種，包括連糯一號、浙優(yōu)18、鄂豐28、南粳5055、II優(yōu)7954遠(yuǎn)雜綠稻Q7、徐旱1號、淮粳5號、紫香米、南粳9108、武育糯16號、綠旱、6兩優(yōu) 9368、旱稻 998、川香優(yōu) 2號、錢優(yōu)0506、岡優(yōu)177、鎮(zhèn)秈優(yōu)184、錢優(yōu)1號、春優(yōu)84、徽兩優(yōu)898、川優(yōu)6203、黑稻、錢優(yōu)0508、龍慶稻1號、超級旱稻502、龍稻20、岡優(yōu)7954、富禾66、旱稻65、深兩優(yōu)5183、蘇育糯、黑糯米、荊兩優(yōu)1198、II優(yōu)1259、鄭旱6號、揚粳687、綠糯米、中優(yōu)188、東農(nóng)425、鎮(zhèn)糯19號、鹽粳6號、Ⅱ優(yōu)98、屜優(yōu)267

（2）供試試劑：酒石酸銻鉀，KSbC4H4O7·1/2H2O，AR，上海試四赫維化工有限公司；焦銻酸鉀，K2H2Sb2O7·4H2O，AR，上海試四赫維化工有限公司；實驗過程中所使用的試劑均為分析純；去離子水。

（3）供試儀器：多功能環(huán)境培養(yǎng)箱（MLR-351H，三洋，日本）；原子熒光光度計（AFS-230E，北京海光儀器公司）；萊伯泰科微控數(shù)顯電熱板（EG35A Plus，浙江納德科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（TG16-WS，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 72 h根伸長毒性測試

選取飽滿的水稻種子，洗凈，經(jīng)消毒、泡種、催芽之后，挑選根長一致的幼芽移植到500 mL裝有營養(yǎng)液的PVC罐中，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）處理下的各種不同濃度均設(shè)置3個平行，每個平行中有6株幼芽，營養(yǎng)液是1/4強度IRRI營養(yǎng)液[14]，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的暴露濃度分別為：0.00、0.31、0.61、3.07、6.14、30.69、61.38、92.07 mg·L-1和 0.00、0.51、2.54、5.08、25.38、50.78、76.17、101.55 mg·L-1等8個濃度梯度。通過HNO3和NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH到5.5。將裝有營養(yǎng)液和幼芽的PVC罐置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。72 h之后拍下幼芽的照片，以Image J處理圖片測得水稻根伸長，記錄并計算根伸長的平均值、相對根伸長（Relative root elongation，RRE）。RRE計算公式為：

式中：RLT是指不同濃度Sb（Ⅲ）或Sb（Ⅴ）處理下樣品的根長，RLC是RLT對應(yīng)處理下的對照組根長；RLS代表初始根長。

EC50常指半數(shù)最大效應(yīng)濃度，在本實驗中表示相對根伸長RRE為50%時暴露液的濃度，EC50是定量反應(yīng)Sb對水稻的脅迫能力大小的一個指標(biāo)，EC50越大說明Sb的毒性越小，反之Sb的毒性越大。EC50可以根據(jù)Haanstra等定義的對數(shù)模型計算，對數(shù)模型公式如下[15]：

式中：RRE為記錄的相對根伸長或者Sb濃度通過擬合得到的相對根伸長，ɑ是表示抑制比率參數(shù)，b是相對根伸長為50%時暴露液Sb濃度的對數(shù)，x是Sb濃度的自然對數(shù)。

1.2.2 水稻根中Sb總濃度的測定

毒性暴露試驗結(jié)束后，收集水稻根，用去離子水漂洗3～4次后，所有的根都放進(jìn)烘箱中，90℃殺青1 h，70℃烘干至恒質(zhì)量。稱質(zhì)量后置于50 mL錐形瓶中，加入適量的硝酸并放上小漏斗，放置在通風(fēng)櫥中冷消解一夜。次日，進(jìn)行消解，定容，用原子熒光光度計（AFS）測定[16]。Sb的檢測限是20 μg·L-1。標(biāo)準(zhǔn)樣品（GBW10015菠菜）用于質(zhì)量控制，其回收率為126.67%。同時做試劑空白。

Cmax可根據(jù)Michaelis-Menten方程計算[17]，方程如下：

式中：C是水稻根中Sb的濃度，Cmax是水稻根吸收Sb的最大濃度，Kmax是最大吸收常數(shù)，x是培養(yǎng)液中Sb的濃度。

1.2.3 酶指標(biāo)測定

經(jīng)2.2.1和2.2.2實驗篩選出的紫香米、揚粳687、深兩優(yōu)5183和徐旱1號作為試驗水稻，經(jīng)過消毒和催芽處理后，開展根伸長抑制試驗，Sb的暴露濃度為6.09 mg·L-1。以1/4 IRRI來配制培養(yǎng)液，選擇根長一致的幼芽，培養(yǎng)72 h后將根剪下并稱鮮重，然后用破碎機(jī)進(jìn)行破碎組織，離心，顯色，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，用WST-1法測定SOD活力，用酶標(biāo)儀比色法測定MDA含量[18]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根長通過ImageJ（國立健康研究所，美國）處理；根伸長計算用Excel處理；EC50半數(shù)最大效應(yīng)濃度曲線和最大吸收曲線通過OriginPro 8.5擬合。采用單因素并結(jié)合多重比較法（Tukey檢驗）比較各品種之間的顯著性（P＜0.05）。本實驗所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件，采用OriginPro 8.5畫圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同形態(tài)的Sb對水稻根伸長的脅迫

不同形態(tài)的Sb均能抑制水稻根系的生長，且相較于Sb（Ⅴ），Sb（Ⅲ）對水稻根系形態(tài)各指標(biāo)的影響比較大[19]。Sb、As為同族元素，兩者之間的性質(zhì)有很多相似之處，有研究表明水稻不同品種耐As性存在差異[20]，本研究表明不同品種水稻對Sb的耐性也存在差異。不同品種水稻的EC50結(jié)果如圖1、圖2，由此可見Sb（Ⅲ）的毒性比Sb（Ⅴ）的毒性大，且不同基因型水稻對Sb的敏感性存在顯著差異（P＜0.05）（數(shù)據(jù)未列出）。如圖 1 所示，揚粳 687 的 EC50，Sb（Ⅲ）值最小為0.82 mg·L-1，表明揚粳687是對Sb（Ⅲ）的敏感品種；徐旱 1號的EC50，Sb（Ⅲ）值最大為 100.24 mg·L-1，表明徐旱1號是Sb（Ⅲ）的耐性品種，徐旱1號的EC50，Sb（Ⅲ）是揚粳687的122倍。如圖2所示，EC50，Sb（Ⅴ）最小的是深兩優(yōu)5183值為13.34 mg·L-1，表明深兩優(yōu)5183是Sb（Ⅴ）的敏感品種；EC50，Sb（Ⅴ）最大的是紫香米值為 776.78 mg·L-1，表明紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品種，紫香米的EC50，Sb（Ⅴ）是深兩優(yōu)5183 的58倍。

圖1 Sb（Ⅲ）對不同品種水稻EC50的影響Figure 1 Effect of Sb（Ⅲ）on EC50of different rice

2.2 不同品種水稻根對Sb的吸收

根系是植物吸收礦物質(zhì)營養(yǎng)和水分的主要器官，植物能夠通過減少根部與重金屬的接觸面積，從而降低對重金屬的吸收[19]。根對重金屬的吸收量在一定程度上影響整株植物對重金屬的吸收量。不同形態(tài)的Sb進(jìn)入水稻的方式不同，且水稻對Sb的吸收速率也不一樣[11]。

不同品種水稻對Sb的吸收最大值也有顯著差異（P＜0.05）（數(shù)據(jù)未列出），結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3可見，不同品種的水稻對Sb（Ⅲ）的吸收最大值在5～12 mg·kg-1之間，敏感品種揚粳687的最大吸收值為8.43 mg·kg-1，耐性品種徐旱1號的最大吸收值為6.09 mg·kg-1。由圖4可見，水稻對Sb（Ⅴ）的最大吸收值在0.5～11.5 mg·kg-1之間，敏感品種深兩優(yōu)5183的最大吸收值為1.69 mg·kg-1，耐性品種紫香米的最大吸收值為2.06 mg·kg-1。本研究結(jié)果驗證了Sb（Ⅲ）處理下的水稻根吸收Sb含量高于Sb（Ⅴ）處理的結(jié)論。

2.3 Sb的致毒機(jī)理

2.3.1 相對根伸長

重金屬對植物的發(fā)芽率、根伸長及一些根部的形態(tài)變化有一定的影響，其中根伸長的變化是植物對重金屬脅迫最直觀的指標(biāo)之一。由圖5A可見，水稻在Sb（Ⅲ）處理下的相對根伸長小于Sb（Ⅴ）處理組，揚粳687、深兩優(yōu)5183和紫香米在不同的Sb處理下存在顯著差異（P＜0.05），徐旱1號在不同的Sb處理下沒有顯著的差異（P＞0.05）。對照組、Sb（Ⅲ）處理組和Sb（Ⅴ）處理組徐旱1號的根伸長抑制率分別為：0、21.92%和22.86%，紫香米的根伸長抑制率分別為：0、46.75%、35.40%。

圖2 Sb（Ⅴ）對不同品種水稻EC50的影響Figure 2 Effect of Sb（Ⅴ）on EC50of different rice

圖3 Sb（Ⅲ）培養(yǎng)下不同品種水稻對Sb的最大吸收量Figure 3 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅲ）culture

2.3.2 Sb的吸收量差異

植物體內(nèi)過量的Sb會影響植物的生長，5～10 mg·kg-1Sb在植物組織中會損傷植物的生長[21]。本研究結(jié)果顯示如圖5B，6.09 mg·L-1Sb處理組，水稻的根部Sb含量均小于5 mg·kg-1，表明在該濃度下植物的生長受到的損傷不嚴(yán)重。不同Sb處理的水稻根部對Sb吸收存在著顯著差異，有研究表明Sb（Ⅲ）處理組的一些植物根吸收Sb濃度大約是Sb（Ⅴ）處理組的3倍[22]。本研究的結(jié)果顯示，在Sb（Ⅲ）處理下這四種水稻根的Sb含量是Sb（Ⅴ）處理組的5倍。兩個結(jié)果之間存在偏差可能的原因有兩個：一是實驗所使用的植物不同，二是實驗所用的時間不同。

2.3.3 水稻根在Sb脅迫下超氧化物歧化酶的差異

SOD（超氧化物歧化酶）是生物體內(nèi)普遍存在的酶之一，在ROS防御機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用，它能夠降低膜脂過氧化作用，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[23]?？寡趸徒舛臼黔h(huán)境脅迫的第一道防線[24]，但增加污染物濃度可能導(dǎo)致這些過程的崩潰和其他相關(guān)反應(yīng)的刺激[25]，SOD活力的降低表明對細(xì)胞的毒性超過細(xì)胞的極限，造成了SOD的消耗或者造成SOD瞬間保護(hù)不足[26]。研究表明外源As處理下，小于20 mg·kg-1時As濃度增加時植物體內(nèi)SOD增加，說明SOD在低As條件下在保護(hù)植物方面起著重要的作用；外源As大于20 mg·kg-1時，As增加時植物體內(nèi)的SOD呈減少趨勢，是植物中毒現(xiàn)象[27]。Chai等研究發(fā)現(xiàn)Sb的存在降低了苧麻（Boehmeriɑ niveɑ）中SOD含量，但存在明顯的濃度效應(yīng)，40 mg·L-1的Sb顯著降低了SOD酶活性，但隨著濃度的進(jìn)一步增加，SOD酶活性又顯著增加[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn) 6.09 mg·L-1的 Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）處理均顯著增加了水稻根中SOD酶活性，與Sb（Ⅲ）相比，Sb（Ⅴ）處理增加更為顯著（圖6A）。

圖4 Sb（Ⅴ）培養(yǎng)下不同品種水稻對Sb的最大吸收量Figure 4 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅴ）culture

圖5 不同處理下水稻相對根伸長（A）和Sb總量（B）的比較Figure 5 The relative root elongation（A）and the concentration of rice（B）with different Sb treatments

2.3.4 水稻根在Sb脅迫下丙二醛的差異

丙二醛（MDA）是過量的活性氧指數(shù)和細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物，可作為應(yīng)激化條件下脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的指標(biāo)[23]。MDA含量的增加通常表現(xiàn)為保護(hù)機(jī)制，消耗丙二醛對植物器官有輕微的損害[26]。As濃度的增加導(dǎo)致水稻根莖中MDA的增加是由于As引起的氧化壓力[27]，Sb污染使ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致MDA的含量增加。研究結(jié)果表明（圖6B），水稻根部受到Sb的脅迫之后MDA的含量均比對照組大；且相比于Sb（Ⅴ）處理組，Sb（Ⅲ）處理組的水稻根MDA含量較大，表明水稻幼苗的生長過程中受到Sb（Ⅲ）引起的氧化壓力大于Sb（Ⅴ）引起的氧化壓力，說明該Sb（Ⅲ）對水稻根部的傷害更嚴(yán)重。

3 結(jié)論

根伸長的變化是植物對重金屬脅迫最直觀的指標(biāo)之一，論文以EC50作為水稻耐Sb能力大小的篩選指標(biāo)研究了Sb對水稻的生物毒性，發(fā)現(xiàn)Sb（Ⅲ）對水稻根伸長的毒性顯著大于Sb（Ⅴ），試驗的44種水稻品種中，揚粳687是Sb（Ⅲ）的敏感品種，徐旱1號是Sb（Ⅲ）的耐性品種；深兩優(yōu)5183是Sb（Ⅴ）的敏感品種，紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品種。水稻對不同形態(tài)Sb的吸收差異較大，水稻對Sb的吸收量與水稻對Sb的敏感性之間沒有顯著的相關(guān)性，但是水稻對Sb（Ⅲ）的吸收顯著高于Sb（Ⅴ）。Sb顯著影響了水稻根中SOD酶活性和MDA含量，6.09 mg·L-1的Sb處理增加了水稻根中SOD酶活性，且Sb（Ⅴ）處理顯著高于Sb（Ⅲ）；Sb暴露顯著增加了水稻根中MDA含量，且Sb（Ⅲ）處理顯著高于Sb（Ⅴ），表明Sb（Ⅲ）的毒性要高于Sb（Ⅴ）。

圖6 不同Sb處理下水稻的SOD活力（A）和MDA含量（B）Figure 6 The activity of SOD（A）and the concentration of MDA（B）with different Sb treatments