郭碧林，陳效民，景 峰，張曉玲，楊之江，劉 巍，劉文心

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

鎘（Cd）是毒性極大的重金屬，具有較強(qiáng)的潛伏性、隱蔽性、滯后性、積累性、不可逆轉(zhuǎn)性及降解、治理難度大等特點(diǎn)，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。相關(guān)研究已證實(shí)[1]：低濃度的Cd也會危害人體健康，即使Cd含量未達(dá)到毒害植物的濃度，也會使植物可食部分的Cd含量超出人類的可食用標(biāo)準(zhǔn)。目前我國總耕地面積約為1.2億hm2，而我國受重金屬污染的耕地面積高達(dá)5000萬hm2，其中，中、重度耕地污染面積相當(dāng)于全國耕地總面積的1/40[2]，因此，對我國耕地土壤進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測及污染修復(fù)的行動(dòng)迫在眉睫。

土壤微生物和土壤酶是生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的部分[3]，其中土壤微生物不僅可以促進(jìn)土壤養(yǎng)分和土壤有機(jī)質(zhì)的循環(huán)與轉(zhuǎn)化，而且還參與土壤有機(jī)質(zhì)的礦化和土壤腐殖質(zhì)的形成，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的作用。而土壤酶活性易受到土壤物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)及這三種性質(zhì)共同影響，其活性變化明顯，因此可直接反映土壤生物化學(xué)過程的方向和強(qiáng)度，可作為評價(jià)土壤肥力的一個(gè)靈敏性生物指標(biāo)[4]。有研究表明，土壤微生物生物量和土壤酶活性與重金屬污染程度存在顯著的負(fù)相關(guān)[5-6]。段學(xué)軍等[7]的研究表明，適量濃度的Cd含量可以刺激土壤微生物生長，提高土壤酶活性。

紅壤是我國亞熱帶地區(qū)的主要土壤類型，而水稻土又是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的土壤種類之一，由于過量施用化肥農(nóng)藥以及一些不當(dāng)?shù)霓r(nóng)事操作造成了土壤中重金屬含量超標(biāo)[8-9]，從而降低了土壤質(zhì)量和作物品質(zhì)及產(chǎn)量，嚴(yán)重影響了整個(gè)紅壤地區(qū)農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。近年來，我國學(xué)者也對重金屬污染進(jìn)行了大量研究，但大部分的研究主要針對礦區(qū)土壤及旱地土壤，而關(guān)于重金屬污染導(dǎo)致紅壤性水稻土中土壤微生物學(xué)特性發(fā)生變化的研究報(bào)道較少。因此本文以湖南紅壤性水稻土為研究對象，通過野外采集土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究了外源Cd脅迫濃度對紅壤性水稻土中土壤微生物生物量碳、氮和土壤酶活性的影響，探討了外源Cd脅迫濃度與土壤微生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，以期為紅壤性水稻土重金屬污染研究提供生物學(xué)指標(biāo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集及實(shí)驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)區(qū)位于湖南省長沙縣北山鎮(zhèn)榮合橋社區(qū)長沙春雷農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司試驗(yàn)基地（28°26′12″N，113°3′33″E），氣候條件優(yōu)越，年降雨量 1 422.4 mm，年蒸發(fā)量1 382.2 mm，無霜期275 d，年積溫6 480℃，年平均氣溫16.8～17.2℃，日照時(shí)數(shù)1 677.1 h。該地區(qū)土壤是由第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育而來的紅壤性水稻土。于2017年4月17日按5點(diǎn)取樣法采集土壤0～15 cm深度的新鮮土樣，混合均勻后裝入無菌塑料袋中密封帶回實(shí)驗(yàn)室備用。對采集的土樣進(jìn)行風(fēng)干處理，一部分用于測定土壤基本理化性質(zhì)，一部分用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用。

稱取18份過2 mm篩的風(fēng)干土，每份300 g；再分別配制 0、1、3、5、7、10 mg·kg-1濃度梯度的 CdCl2·2.5H2O水溶液500 mL，將土樣分別與不同濃度的CdCl2·2.5H2O水溶液混合均勻，每個(gè)處理重復(fù)3次，使土壤含水量為田間最大持水量的60%（即每份土樣添加101.52 mL的CdCl2·2.5H2O水溶液），使添加Cd濃度分別為0、1、3、5、7、10 mg·kg-1，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，每日定時(shí)取出，用稱重法來控制土樣的含水量，30 d后將土樣風(fēng)干，進(jìn)行各項(xiàng)目的測定。

1.2 分析方法

土壤基本理化性質(zhì)的測定參照《土壤農(nóng)化分析》[10]，土壤全量Cd的測定采用氫氟酸-硝酸-高氯酸消煮，ICP-MS測定；土壤微生物生物量碳、氮含量，測定方法采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法；脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性分別采用靛酚藍(lán)比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法和高錳酸鉀滴定法測定[11]。結(jié)果見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行通徑分析，顯著性水平設(shè)為α=0.05。通徑分析即：將相關(guān)系數(shù)分為直接通徑系數(shù)和間接通徑系數(shù)，更直觀地了解它們的作用方式。其計(jì)算原理：設(shè)在p個(gè)自變量x1，x2，…，xp中，每兩個(gè)變量之間和應(yīng)變量y之間的簡單相關(guān)系數(shù)能夠組成求解通徑系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化正規(guī)方程，即：

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

式中：T1，T2，…，Tp為直接通徑系數(shù)。直接通徑系數(shù)可以通過上述相關(guān)矩陣的逆矩陣計(jì)算獲得。

間接通徑系數(shù)能夠通過相關(guān)系數(shù)和直接通徑系數(shù)的乘積來計(jì)算[12]；決定系數(shù)可通過相關(guān)系數(shù)、直接通徑系數(shù)與間接通徑系數(shù)總和三者來計(jì)算，即：決定系數(shù)=相關(guān)系數(shù)×直接通徑系數(shù)+間接通徑系數(shù)總和×直接通徑系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Cd脅迫對紅壤性水稻土微生物生物量碳、氮的影響

圖1外源Cd脅迫對水稻土微生物生物量碳、氮的影響Figure 1 Effects of cadmium stress on microbial biomass carbon，nitrogen in paddy soil

圖1 顯示了外源Cd脅迫對紅壤性水稻土微生物生物量碳、氮的影響。隨著外源Cd濃度的增加，土壤微生物生物量碳、氮含量較對照均呈先增加后減少的趨勢。在外源Cd脅迫濃度為1 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量碳、氮含量呈增加的趨勢，其中土壤微生物生物量氮含量較對照顯著增加（P＜0.05），增幅為22.85%；隨著外源Cd脅迫濃度的繼續(xù)上升，土壤微生物生物量碳、氮含量逐漸下降，且外源Cd脅迫濃度越高，下降趨勢越明顯。在外源Cd脅迫濃度分別為7 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量碳含量較對照分別降低了36.96%和41.32%；而在外源Cd脅迫濃度分別為3、5、7 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量氮含量顯著降低，較對照分別降低了43.99%、57.37%、67.07%和74.42%。

2.2 外源Cd脅迫對紅壤性水稻土酶活性的影響

土壤酶活性是反映土壤肥力狀況、土壤自凈能力以及土壤重金屬污染程度的重要指標(biāo)。由表2可知，過氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均隨外源Cd脅迫濃度的增加而減少，且外源Cd脅迫濃度越大下降趨勢越明顯；而蔗糖酶活性則表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。在外源Cd脅迫濃度為1 mg·kg-1時(shí)，與對照相比，過氧化氫酶和脲酶活性均顯著降低（P＜0.05），較對照分別下降了6.70%和15.50%；當(dāng)外源Cd脅迫達(dá)到3 mg·kg-1時(shí)，與對照相比，過氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均顯著降低，而蔗糖酶活性則顯著升高；當(dāng)外源Cd脅迫濃度為7 mg·kg-1時(shí)，蔗糖酶活性達(dá)最大值，較對照增加了12.74%；當(dāng)外源Cd脅迫濃度為10 mg·kg-1時(shí)，過氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均達(dá)最低值，較對照分別下降了25%、34.88%和14.52%，而蔗糖酶活性較對照增加了6.37%。

表2 Cd脅迫對水稻土酶活性的影響Table 2 Effects of cadmium stress on enzyme activities in paddy soil

2.3 Cd脅迫濃度與微生物學(xué)指標(biāo)之間的通徑分析

為了進(jìn)一步探討重金屬Cd對微生物學(xué)指標(biāo)影響，利用通徑分析統(tǒng)計(jì)方法將重金屬Cd與微生物學(xué)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分為直接作用和間接作用。從表3可知，Cd脅迫對微生物生物量碳的直接作用最大（直接通徑系數(shù)為-1.110），其余按直接通徑系數(shù)大?。ń^對值）從大到小依次為脫氫酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、微生物生物量氮和脲酶。其中Cd脅迫對蔗糖酶的直接影響是正效應(yīng)，而對其他微生物學(xué)指標(biāo)的直接影響則是負(fù)效應(yīng)。外源Cd脅迫對微生物生物量碳、過氧化氫酶、脫氫酶這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的直接通徑系數(shù)均顯著大于各自間接通徑系數(shù)總和，且這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的間接作用系數(shù)總和很小，說明了Cd脅迫對這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的影響主要是體現(xiàn)在直接作用上，與其他微生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)作用較弱，其余微生物學(xué)指標(biāo)與Cd脅迫濃度的直接通徑系數(shù)相關(guān)性較低，隨著Cd脅迫濃度的增加，過氧化氫酶和脫氫酶活性減少。通過表3中的間接通徑系數(shù)總和可知，微生物生物量氮和脲酶的間接通徑系數(shù)之和遠(yuǎn)大于其直接通徑系數(shù)，分別是-0.687和-0.587，與其他微生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)作用較強(qiáng)，說明外源Cd主要通過影響其他微生物指標(biāo)活性間接影響該指標(biāo)的活性。其中蔗糖酶的直接通徑系數(shù)為0.675，間接通徑系數(shù)之和為-1.212，其間接通徑系數(shù)之和大于直接通徑系數(shù)，說明外源Cd的加入通過影響土壤理化性質(zhì)和其他微生物學(xué)指標(biāo)來間接影響土壤蔗糖酶活性，并使間接作用略大于直接作用，從而導(dǎo)致了蔗糖酶的變化趨勢異于其他微生物學(xué)指標(biāo)的變化趨勢。

由表3可知，外源Cd脅迫與各微生物學(xué)指標(biāo)存在極顯著的相關(guān)性，其中Cd與脫氫酶的相關(guān)性最大，對其他微生物學(xué)指標(biāo)相關(guān)性（絕對值）從大到小依次為：過氧化氫酶、微生物生物量氮、微生物生物量碳、脲酶、蔗糖酶。而通過計(jì)算得出的決定系數(shù)表明，外源Cd脅迫對脫氫酶的綜合決定能力最大，對其他微生物學(xué)指標(biāo)的綜合決定能力大?。ń^對值）依次是：過氧化氫酶、微生物生物量碳、蔗糖酶、微生物生物量氮和脲酶。

3 討論

3.1 Cd脅迫對土壤微生物生物量的影響

土壤微生物生物量碳是土壤中活性有機(jī)質(zhì)的重要組成部分，其含量僅占土壤有機(jī)質(zhì)的1%～4%，但在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而土壤微生物生物量氮含量是衡量土壤重金屬污染程度的重要指標(biāo)，可用于評價(jià)土壤質(zhì)量，指示土壤生態(tài)系統(tǒng)變化狀況[13-14]。韓桂琪等[15]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重金屬Cd、Zn、Cu和Pb復(fù)合污染對微生物生物量的影響與其濃度有關(guān)，在較低濃度時(shí)刺激微生物生物量的增加，而高濃度時(shí)則表現(xiàn)為抑制；趙輝等[16]通過以菜地土為盆栽試驗(yàn)的供試土壤進(jìn)行試驗(yàn)表明，低濃度Cd（≤2.0 mg·kg-1），可增加土壤中微生物生物量碳含量；而王秀麗等[17]研究則表明，銅鋅冶煉廠附近的水稻土中土壤微生物生物量碳、氮含量隨Cd脅迫濃度的增加而逐漸減少。由此可以得出，土壤重金屬污染對土壤微生物生物量的影響主要與重金屬的含量有關(guān)。在本研究中Cd脅迫對湖南紅壤性水稻土土壤微生物生物量碳、氮含量影響的變化趨勢基本相同，隨著Cd脅迫濃度的增加，與對照相比微生物生物量碳、氮含量均呈先增加后減少的趨勢，這與曾路生等[18]研究結(jié)果基本一致。由表3可知，微生物生物量碳含量主要是外源Cd的直接作用的結(jié)果，這可能是因?yàn)镃d是土壤微量元素的一種，低濃度時(shí)可以刺激土壤微生物的生長發(fā)育和繁殖[19]，加強(qiáng)微生物活動(dòng)，在一定程度下增加土壤微生物生物量碳含量，而隨著Cd脅迫濃度的增加，Cd的毒害作用大于刺激作用，進(jìn)而抑制了土壤微生物的生長和繁殖，影響微生物種群的生存能力或競爭能力，導(dǎo)致微生物生物量碳含量降低。從表3可得，微生物生物量氮含量變化主要是外源Cd的直接作用和間接作用的結(jié)果，其中外源Cd的間接作用占主導(dǎo)因素。外源Cd通過影響土壤微生物和土壤酶活性間接導(dǎo)致了土壤微生物生物量氮含量先增大后減小。

表3 Cd脅迫濃度與微生物學(xué)指標(biāo)之間的通徑分析Table 3 Path analysis between cadmium stress and microbiological indicators

3.2 Cd脅迫對土壤酶的影響

土壤酶主要源于土壤微生物的分泌，是土壤結(jié)構(gòu)中的重要組成部分[20]。在本研究中，隨著外源Cd脅迫濃度的增加，脫氫酶、過氧化氫酶和脲酶的活性逐漸降低，且與外源Cd脅迫濃度表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)，通過通徑分析可知，外源Cd對過氧化氫酶和脫氫酶活性的直接抑制作用（-1.008，-1.048）大于間接促進(jìn)作用（0.127，0.098）；外源Cd對脲酶活性的直接抑制作用（-0.161）和間接抑制作用（-0.587）均造成了土壤脲酶活性下降；而外源Cd對蔗糖酶的直接促進(jìn)作用（0.675）小于間接抑制作用（-1.212）。外源Cd抑制脫氫酶、過氧化氫酶和脲酶活性機(jī)理主要是因?yàn)镃d2+可以與酶分子中的活性部位-巰基和含咪唑的配位體等結(jié)合，形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而與底物發(fā)生競爭作用，抑制酶活性；其次是由于重金屬污染土壤微生物的生存環(huán)境，抑制了土壤微生物的生長和繁殖，從而減少了體內(nèi)酶的分泌和合成，最后導(dǎo)致土壤酶活性下降[21]；而蔗糖酶活性隨著外源Cd脅迫濃度的增加表現(xiàn)出先下降再上升后下降的趨勢，這與吳丹等[22]研究結(jié)果相似，因?yàn)镃d對蔗糖酶活性具有刺激作用，Cd的加入可以促進(jìn)酶的活性中心與底物間的配位結(jié)合，保持酶分子的專性結(jié)構(gòu)，同時(shí)改變了酶催化反應(yīng)的平衡條件，增加了蔗糖酶活性，而后隨著Cd脅迫濃度的增加，Cd占據(jù)了酶分子的活性中心，或與酶分子的羧基、巰基和氨基等相結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低[23]。

3.3 微生物生物量與土壤酶活性的相互作用

土壤酶主要來源于土壤微生物，而土壤酶活性與土壤微生物的數(shù)量、生物量、多樣性以及土壤動(dòng)物的數(shù)量呈顯著或極顯著正相關(guān)[24]。通徑分析表明，Cd脅迫對各個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的影響是相互的，Cd脅迫對微生物生物量氮、脲酶及蔗糖酶活性的影響除了其本身的直接作用外，主要還是通過Cd脅迫對其他微生物學(xué)指標(biāo)的影響來間接影響它們的活性，其間接作用大于直接作用；對于微生物生物量碳、過氧化氫酶及脫氫酶活性而言，Cd對其活性的影響是直接的，其中對微生物生物量碳的直接作用最大（-1.110）。在本研究中，土壤中各微生物學(xué)指標(biāo)（微生物生物量碳、氮、過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶）都可衡量土壤重金屬污染程度，其中Cd脅迫與脫氫酶的相關(guān)系數(shù)最大（r=-0.952**）。因此，用脫氫酶活性衡量重金屬污染程度更為準(zhǔn)確，可作為湖南紅壤性水稻土Cd污染土壤質(zhì)量評價(jià)的靈敏指標(biāo)。

4 結(jié)論

（1）對湖南紅壤性水稻土進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)可知，土壤微生物量和酶活性隨外源Cd脅迫濃度的變化而相應(yīng)變化，微生物量和蔗糖酶活性隨外源Cd脅迫濃度的增加先增加后減少，而過氧化氫酶、脫氫酶和脲酶活性則隨著Cd脅迫濃度的增加而顯著降低。

（2）通徑分析表明土壤微生物生物量碳、氮、過氧化氫酶、脲酶和脫氫酶與Cd脅迫濃度存在極顯著（P＜0.01）的負(fù)相關(guān)，而蔗糖酶與Cd脅迫濃度存在極顯著（P＜0.01）的正相關(guān)；它們均可作為衡量土壤重金屬污染程度的敏感指標(biāo)，其中脫氫酶與Cd脅迫濃度的相關(guān)性最大，能夠更加準(zhǔn)確地衡量湖南紅壤性水稻土Cd污染程度；與微生物生物量碳的直接通徑系數(shù)最大，與脲酶的直接通徑系數(shù)最小。