余 浩，王幽靜，宋 睿，潘彥碩，王長青，劉炳杉，李本銀，李烜楨*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣州510642；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)管理中心，鄭州 450002；5.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，鄭州 450002）

隨著社會(huì)不斷發(fā)展，土壤污染問題越來越嚴(yán)重，其中土壤重金屬污染問題尤其突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國受重金屬污染的耕地占總耕地面積的五分之一，其中Cd污染最為嚴(yán)重[1]。土壤受Cd污染后，會(huì)通過生物富集作用進(jìn)入人體，危害人體健康。目前土壤重金屬污染修復(fù)方法主要有物理、化學(xué)和生物方法等，但物理和化學(xué)方法修復(fù)成本高，并且會(huì)在一定程度上破壞土壤結(jié)構(gòu)，容易造成二次污染，因此不適用于農(nóng)田污染治理[2-3]。植物修復(fù)技術(shù)因具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)田土壤重金屬污染的修復(fù)[4]。

目前發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物，如有翅星蕨（Microsorum pteropus）、遏藍(lán)菜（Thlɑspi cɑerulescens）等，多因生長緩慢、生物量低、栽培困難等較難應(yīng)用于實(shí)際[5-6]。煙草是世界上較廣泛種植的一種作物，其生物量大，并且對(duì)重金屬有較強(qiáng)的吸收和積累能力，因此煙草可能被用于土壤重金屬污染的修復(fù)[7]。張艷玲等[8]研究了497份烤煙樣品的重金屬含量發(fā)現(xiàn)，煙草中Cd含量遠(yuǎn)高于其他重金屬，葉片平均Cd含量為2.95 mg·kg-1，最高可達(dá)19.35 mg·kg-1。煙草對(duì)Cd的吸收積累能力品種間差異明顯，劉登璐等[9]對(duì)93個(gè)煙草品種的Cd耐受性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了“達(dá)白一號(hào)”、“長脖黃”等多個(gè)對(duì)Cd具有高積累特性的品種。目前關(guān)于煙草富集重金屬的研究不多，且大都集中在篩選Cd的低積累品種用于煙草栽培，而很少有人從環(huán)境角度考慮將煙草用于土壤重金屬污染的修復(fù)。

本研究以來源廣泛的7個(gè)煙草品種為供試材料，采用盆栽實(shí)驗(yàn)方法，研究了Cd脅迫下不同品種煙草的生長狀況，探索了Cd在煙草不同器官的分布規(guī)律，初步篩選了對(duì)Cd富集能力強(qiáng)的品種，還研究了Cd脅迫下煙草根際有機(jī)酸的分泌特征，以期為Cd污染土壤的現(xiàn)實(shí)修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

煙草品種為中煙100、粵煙96、NC628、K326、長脖黃、云煙87和8326，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)提供。供試土壤采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，土壤類型為褐土，采樣深度為0～20 cm，將土壤風(fēng)干后，去除動(dòng)植物殘?jiān)?、碎石，過2 mm篩，備用。

土壤pH采用水浸提，微機(jī)型酸度計(jì)（杭州齊威儀器有限公司）測定（水∶土=2.5∶1）；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法檢測；速效磷采用NaHCO3溶液浸提，鉬銻抗比色法檢測；速效鉀采用醋酸銨浸提，火焰光度計(jì)（上海傲譜）檢測；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法檢測；全Cd采用微波消解（美國CEM），原子吸收分光光度計(jì)檢測（日本日立公司Z-2000）。所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，供試土壤基本性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of the experimental soil

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

實(shí)驗(yàn)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)氣候室進(jìn)行，向土壤（過2 mm篩）中添加CdCl2粉末（無結(jié)晶水），采用“二分法”混土，將652 mg CdCl2粉末混于40 kg土中（理想條件下混合后Cd含量接近10 mg·kg-1）；先將163 mg CdCl2粉末和200 g土小范圍均勻混合，再加入163 mg CdCl2和200 g土繼續(xù)均勻混合，連續(xù)添加將652 mg CdCl2混于1 kg土中；再按照上述方法將含有Cd的1 kg土與39 kg土混合。平衡一周后，5點(diǎn)取樣法取樣，測定Cd含量為9.4 mg·kg-1，分裝。每個(gè)煙草品種均設(shè)5個(gè)重復(fù)，以不種煙草作為對(duì)照。基肥（煙草專用肥不含Cd）與土壤均勻混合后裝入塑料盆缽中，選擇生長狀況均勻一致的煙苗（四葉一心）移栽，每盆1.0 kg土定植一株。每天光照10 h，溫度28℃；夜晚14 h，溫度18℃；濕度為70%。

1.3 樣品采集與測定

煙株移栽30 d后采集樣品，先用抖土法[10]去掉非根際土，然后用毛刷將附著在根系周圍的土壤輕輕刷下來作為根際土，保存至-20℃冰箱備用。隨后將去土后的煙株用蒸餾水潤洗，再用去離子水反復(fù)沖洗干凈，用不銹鋼剪刀將根、莖、葉分開，于105℃下殺青30 min，65℃烘干至恒質(zhì)量并稱量，經(jīng)微波消解[11]后，趕酸，轉(zhuǎn)移并定容至25 mL，用乙炔-火焰原子吸收光譜法測定煙草中Cd含量。

有機(jī)酸測定：測定根際土壤中草酸、蘋果酸、檸檬酸、甲酸和乙酸的含量，有機(jī)酸均為色譜純。稱取根際土壤樣品5 g于25 mL離心管中，加10 mL 0.1%的H3PO4水溶液，振蕩3 min 后，在 5000 r·min-1轉(zhuǎn)速下，離心5 min。過水相0.45 μm濾膜，用高效液相色譜儀（美國Agilent公司）檢測。色譜條件：流動(dòng)相為0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（pH=2.7）；進(jìn)樣量為20 μL；流速0.5 mL·min-1；柱溫 30 ℃；檢測波長210 nm[10]。

根富集系數(shù)=煙草根Cd含量/土壤Cd含量

莖富集系數(shù)=煙草莖Cd含量/土壤Cd含量

葉富集系數(shù)=煙草葉Cd含量/土壤Cd含量

去除率=（根Cd含量×根生物量+莖Cd含量×莖生物量+葉Cd含量×葉生物量）/（土壤Cd含量×土壤質(zhì)量）×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用Excel 2016處理，SPSS17.0顯著性分析，Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種煙草生物量的差異

本研究通過盆栽實(shí)驗(yàn)比較了Cd脅迫下不同品種煙草生物量（干質(zhì)量）的差異（圖1），在土壤Cd含量為9.4 mg·kg-1條件下，不同品種煙草生物量呈現(xiàn)葉＞莖＞根的趨勢。“長脖黃”根、莖和葉的生物量均最大，分別為1.17、1.45 g和4.3 g，“長脖黃”葉的生物量與其他品種間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖1 不同品種煙草生物量Figure 1 Tobacco biomass of different varieties

2.2 不同品種煙草根、莖和葉Cd含量

通過檢測煙草根、莖和葉中的Cd含量發(fā)現(xiàn)（圖2），“云煙87”葉 Cd含量最高，達(dá) 64.67 mg·kg-1，其次為“8326”和“長脖黃”；“長脖黃”莖Cd含量最高，達(dá)27.1 mg·kg-1，其次為“中煙100”和“云煙87”；“8326”根Cd含量最高，達(dá) 23.75 mg·kg-1，其次為“粵煙 96”和“NC628”。不同器官的Cd含量均呈葉＞莖＞根的趨勢，例如“長脖黃”根、莖、葉Cd含量分別為14.3、27.1、63.02 mg·kg-1。煙草葉片中Cd含量遠(yuǎn)高于根和莖，這種現(xiàn)象說明煙草生長期間對(duì)Cd有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。

圖2不同品種煙草根、莖和葉Cd含量Figure 2 Cd concentration in roots，stems and leaves of different varieties of tobacco

2.3 不同品種煙草對(duì)Cd的富集系數(shù)

圖3 顯示“云煙87”葉對(duì)Cd的富集系數(shù)最高達(dá)6.88，其次為“8326”（6.77）和“長脖黃”（6.7）；“長脖黃”莖對(duì)Cd的富集系數(shù)最高達(dá)2.88，其次為“中煙100”（2.84）和“云煙 87”（2.82）；“8326”根富集系數(shù)最高達(dá)2.53，其次是“粵煙96”（1.81）和“NC628”（1.54）。煙草不同器官富集系數(shù)均呈現(xiàn)葉＞莖＞根。Baker[12]認(rèn)為，超累積植物富集系數(shù)遠(yuǎn)大于1，而排斥型作物富集系數(shù)通常小于1。以此標(biāo)準(zhǔn)判斷，在9.4 mg·kg-1條件下，煙草不同器官對(duì)Cd的富集系數(shù)均大于1，其中煙草品種“云煙87”葉對(duì)Cd的富集系數(shù)達(dá)到6.88，說明煙草對(duì)Cd有比較強(qiáng)的富集能力，有望用于實(shí)際土壤Cd污染修復(fù)中。

圖3 不同品種煙草對(duì)Cd的富集系數(shù)Figure 3 Enrichment coefficient of different varieties of tobacco to Cd

2.4 不同品種煙草對(duì)Cd的去除率

修復(fù)植物對(duì)土壤中重金屬的去除率是評(píng)價(jià)植物修復(fù)能力的最終指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)“長脖黃”對(duì)Cd的去除率最高為3.48%，“NC628”對(duì)Cd的去除率最低為2.21%，兩者相差36.5%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）（圖4）。楊勇等[6]通過盆栽實(shí)驗(yàn)比較超富集植物印度芥菜、遏藍(lán)菜和高生物量植物煙草對(duì)土壤中Cd的去除率，發(fā)現(xiàn)在1.0 kg土中生長60 d后，煙草對(duì)Cd的去除率遠(yuǎn)高于遏藍(lán)菜和印度芥菜。

圖4 不同品種煙草對(duì)Cd的去除率Figure 4 Cd removal rate of different varieties of tobacco

2.5 Cd脅迫下不同品種煙草根系分泌的有機(jī)酸

本文研究了不同品種煙草根際土壤5種有機(jī)酸含量，發(fā)現(xiàn)不同品種煙草根際土壤中均檢測到了草酸；除粵煙96外，其他煙草品種根際土壤均檢測到了乙酸，“中煙100”和“粵煙96”根際土壤中檢測出少量蘋果酸；“粵煙96”和“8326”根際土壤中檢測出少量甲酸；在對(duì)照土壤中檢測出少量的草酸、蘋果酸和乙酸（表2）。不同品種煙草根際土壤中檢測出草酸的含量均遠(yuǎn)高于其他酸，其中“長脖黃”分泌的草酸含量最高達(dá) 16.23 mg·kg-1，“NC628”最低為 10.2 mg·kg-1，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；“NC628”乙酸含量最高為 0.31 mg·kg-1，“云煙 87”乙酸含量最低為 0.2 mg·kg-1，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（表2）。

3 討論

有學(xué)者[13]研究了多種高生物量植物對(duì)重金屬的富集能力，發(fā)現(xiàn)用于植物修復(fù)技術(shù)的植物種類不一定局限于超富集植物，尋找與開發(fā)大生物量、富集重金屬能力強(qiáng)的修復(fù)植物是首要任務(wù)。從圖1看出煙草品種“長脖黃”生物量比其他品種大，且生長過程中未出現(xiàn)明顯毒害現(xiàn)象。本研究為室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)，煙草的生長期為30 d，因此生物量比大田生長的小。在大田生長條件下，“長脖黃”屬于高產(chǎn)品種，據(jù)報(bào)道其僅煙葉產(chǎn)量（干質(zhì)量）可達(dá)3000 kg·hm-2，因此具備了進(jìn)行土壤重金屬污染修復(fù)的先決條件[14-15]。

本試驗(yàn)研究表明（圖2）不同品種煙草對(duì)Cd均有較強(qiáng)的富集能力，并且葉片為煙草儲(chǔ)存Cd的主要場所，這與其他研究結(jié)果類似，例如袁祖麗[16]通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中Cd的添加量達(dá)到10 mg·kg-1左右時(shí)，煙草葉片Cd含量高于根；賀元等[17]通過盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cd含量在4.8 mg·kg-1下煙草葉片中的Cd含量（110 mg·kg-1）顯著高于莖（25 mg·kg-1）和根（12 mg·kg-1）。其他植物類似，如朱艷霞[18]發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下東南景天不同部位 Cd含量為葉（180 mg·kg-1）＞莖（100 mg·kg-1）＞根（80 mg·kg-1）。有研究表明植物葉片的葉肉細(xì)胞在植物對(duì)Cd的解毒過程中起主要作用，這是因?yàn)镃d主要區(qū)隔在液泡和細(xì)胞壁等代謝不活躍的部位。在葉肉細(xì)胞中有大型液泡，液泡中富含蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和巰基化合物等都能與重金屬結(jié)合降低重金屬毒性；細(xì)胞壁中如木質(zhì)素和各類蛋白等也能與重金屬結(jié)合，因此煙草葉片的Cd含量高于根和莖[19-21]。

富集系數(shù)是衡量植物對(duì)重金屬積累能力的一種重要參考標(biāo)準(zhǔn)，富集系數(shù)越大，說明植物對(duì)重金屬的吸收能力越強(qiáng)[22]。從圖3發(fā)現(xiàn)不同品種煙草均對(duì)Cd有較強(qiáng)的吸收能力。從煙草與超富集植物對(duì)Cd的去除率比較發(fā)現(xiàn)，將高生物量、高富集能力的煙草品種“長脖黃”用于土壤Cd污染修復(fù)是可行的。

根系分泌的有機(jī)酸可能是影響植物吸收重金屬的重要因素[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草品種“長脖黃”對(duì)Cd的去除率最高，同樣根際土壤草酸含量也最高，“NC628”去除率最低，根際土壤草酸含量也最低，因此可以推測，在Cd脅迫下煙草根系分泌較多的低分子量有機(jī)酸尤其是草酸可能是煙草對(duì)Cd具有較高富集能力的原因之一，這可能與有機(jī)酸的解離程度有關(guān)。草酸的解離常數(shù)高，更容易解離和釋放H+，一方面降低了土壤pH，增加Cd的有效性；另一方面與土壤中的Cd螯合，促進(jìn)了土壤中重金屬的釋放和煙草對(duì)重金屬的吸收[24-26]。

表2 Cd脅迫下不同品種煙草根系對(duì)有機(jī)酸的分泌（mg·kg-1）Table 2 Secretion of organic acids from different tobacco roots under Cd stress（mg·kg-1）

4 結(jié)論

（1）在Cd脅迫下，7種供試煙草品種中“長脖黃”對(duì)Cd的去除率最高，因此，該品種有望成為一種新的Cd污染土壤的修復(fù)植物。

（2）不同煙草品種均分泌了草酸，其次為乙酸。在Cd脅迫下煙草根系分泌較多的低分子量有機(jī)酸尤其是草酸可能是煙草對(duì)Cd具有較高富集能力的原因之一。