郜珊珊， 周 娟,3， 袁祖貽,3， 王麗君,3△

(西安交通大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 2陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710061)

多種炎癥免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展都與CD4+T細(xì)胞亞群平衡的改變有關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和過敏性哮喘(allergic asthma)。經(jīng)典觀點(diǎn)認(rèn)為AS的慢性炎癥是以Th1型免疫反應(yīng)為主導(dǎo)的[1-3]，而過敏性哮喘則是以Th2型免疫反應(yīng)為主導(dǎo)[4-6]，兩者代表著CD4+T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的不同方向，但臨床流行病學(xué)研究資料對(duì)兩者的關(guān)系仍未有定論。我們前期研究發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘可以促進(jìn)ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成和發(fā)展，并導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低[7]；Liu等[8]的研究也顯示，急、慢性過敏性肺部炎癥都可以促進(jìn)小鼠AS斑塊面積增加，病變部位炎性細(xì)胞浸潤增加，膠原纖維和平滑肌含量減少，以及損傷細(xì)胞和凋亡增加[9]，但具體機(jī)制目前尚不清楚。已有研究表明白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)[10]，而IgE可以結(jié)合在巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的Fc ε受體(Fc ε receptor, FcεR)，進(jìn)而活化靶細(xì)胞并促進(jìn)炎癥進(jìn)展[9,11-12]。Wang等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的血漿IgE水平顯著升高，且與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)，患者斑塊局部尤其是富含巨噬細(xì)胞區(qū)域的IgE及其受體FcεRI表達(dá)水平增高，提示我們IgE-FcεRI交聯(lián)激活巨噬細(xì)胞可能是導(dǎo)致AS進(jìn)展的一個(gè)重要途徑。本研究擬在過敏性哮喘ApoE-/-鼠模型中，觀察過敏性哮喘加速AS發(fā)生發(fā)展是否與Th2細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL-4有關(guān)，以及IgE-FcεRI交聯(lián)激活巨噬細(xì)胞在其中所發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠是本實(shí)驗(yàn)室的維持品系，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)及氫氧化鋁均購自Sigma；油紅O染料購自Amresco；流式細(xì)胞術(shù)用抗體和相關(guān)試劑購自eBioscience；TRIzol和SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒購自TaKaRa；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fermentas；IL-4 ELISA試劑盒購自RayBiotech；IgE ELISA試劑盒購自Cayman Chemical；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin, Ion)和莫能霉素(monensin，Mon)購自杭州聯(lián)科生物公司；FITC標(biāo)記的抗小鼠IgE購自NOVUS；兔抗小鼠FcεRIα抗體及相應(yīng)的 II 抗購自Santa Cruz；抗IL-4單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)購自R&D；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。Leica恒冷切片機(jī)、Olympus BX51正置熒光顯微鏡、Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀和BioTek自動(dòng)酶標(biāo)儀來自西安交通大學(xué)心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室；Becton流式細(xì)胞儀來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1動(dòng)物模型制備和分組 6周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、哮喘安慰劑干預(yù)(asthma)組和哮喘IL-4 mAb干預(yù)(IL-4 mAb)組(n=6),其中哮喘模型小鼠于第0、7和14天給予腹腔注射OVA+氫氧化鋁佐劑進(jìn)行致敏(每只0.2 mL，含500 mg/L OVA)，并于第14天開始以1% OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作，每周3次，每次30 min，共計(jì)8周，對(duì)照組同時(shí)給予PBS霧化吸入；此外，哮喘IL-4干預(yù)組和哮喘安慰劑干預(yù)組分別給予IL-4 mAb(每次100 μg)和生理鹽水腹腔注射，每周1次，共8周。

2.2標(biāo)本采集 所有小鼠于末次激發(fā)后24 h處死，眼球采血后收集血清并分裝保存于-80 ℃冰箱直至檢測。采血后小心剝?nèi)〔⑵⑴K均分為兩半，一半迅速投入液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于real-time PCR檢測，另一半用RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗后轉(zhuǎn)移到200目的鋼濾網(wǎng)上進(jìn)行充分研磨并收集細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞2次后重懸并計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至8×109/L 待用；取脾后迅速開胸并充分暴露心臟，生理鹽水心臟灌流沖凈血管及組織中的殘留血液，分離并取下主動(dòng)脈根部，4%多聚甲醛固定1 h，25%蔗糖脫水至組織沉底。濾紙吸干多余水分，OCT 復(fù)合物包埋儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱直至切片。

2.3主動(dòng)脈根部斑塊染色 OCT包埋的主動(dòng)脈根部連續(xù)橫切，以見到3 個(gè)主動(dòng)脈瓣為標(biāo)志，連續(xù)收集7 μm 厚的系列冰凍切片共400 μm 長，每張玻片6個(gè)切片。-20 ℃冰箱保存切片。油紅O染色檢測主動(dòng)脈根部的脂質(zhì)含量，以斑塊面積占管腔橫截面積的百分比來代表病變面積的相對(duì)大小。同時(shí)，采用FITC標(biāo)記的抗小鼠IgE抗體進(jìn)行免疫熒光染色檢測斑塊內(nèi)的IgE含量，兔抗小鼠FcεRIα抗體及相應(yīng)的 II 抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法檢測斑塊內(nèi)的FcεRIα含量，以陽性面積占斑塊面積的百分比代表斑塊內(nèi)的IgE和FcεRIα表達(dá)含量。

2.4流式細(xì)胞術(shù) 取2×106脾細(xì)胞懸液，加入25 μg/L PMA、1 mg/L Ion和1.7 mg/L Mon，37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h后，1 500×g離心5 min 后棄去上清；洗滌細(xì)胞后加入100 μL PBS(含0.25 μL CD4-FITC)，4 ℃避光孵育40 min；洗滌細(xì)胞后加入200 μL IC Fixation Buffer,避光孵育20 min；然后直接加入1 mL 破膜緩沖液洗滌細(xì)胞，1 500×g離心5 min 后棄去上清；加入100 μL 破膜緩沖液(含0.625 μL IL-4-PE)，室溫避光孵育20 min；洗滌細(xì)胞后加入500 μL PBS 重懸細(xì)胞，4 ℃保存并于24 h 內(nèi)上機(jī)檢測。

2.5脾臟mRNA提取和real-time PCR檢測 取小鼠脾臟，TRIzol法提取總RNA，F(xiàn)ermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，用SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)檢測各指標(biāo)的表達(dá)。所有引物序列均由上海捷瑞基因公司合成,見表1。用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

2.6ELISA方法檢測血清細(xì)胞因子水平 雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-4和IgE含量，具體操作方法根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)均經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行分析比較，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積的改變

采用油紅O染色檢測各組小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積，結(jié)果顯示過敏性哮喘組小鼠AS斑塊面積較對(duì)照組有顯著增加(P<0.05)；而用IL-4 mAb干預(yù)哮喘組小鼠8周后，斑塊面積被顯著抑制(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The changes of the lesion area in the aortic root of the mice (oil red O staining,×100). Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsasthma group.

圖1小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積的改變

2 小鼠體內(nèi)Th2細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL-4 水平的改變

為了檢測過敏性哮喘對(duì)ApoE-/-小鼠體內(nèi)Th2細(xì)胞含量的影響，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測了CD4+IL-4+T細(xì)胞在脾細(xì)胞懸液中的百分比，結(jié)果顯示過敏性哮喘組小鼠體內(nèi)的Th2細(xì)胞水平較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，見圖2A；除此之外我們還檢測了Th2細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-4在脾臟和血清中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示過敏性哮喘組小鼠脾臟IL-4 mRNA水平和血清含量均較對(duì)照組顯著增高(P<0.05),見圖2B、C。

Figure 2. The effect of allergic asthma on the proportion of Th2 cells (A) and the level of IL-4 (B and C) in the mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2過敏性哮喘對(duì)小鼠體內(nèi)Th2細(xì)胞和IL-4含量的影響

3 小鼠體內(nèi)IgE和FcεRIα表達(dá)水平的改變

我們發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘狀態(tài)可以導(dǎo)致ApoE-/-小鼠AS病變加重同時(shí)體內(nèi)的Th2細(xì)胞和IL-4水平增高；為了觀察IL-4的增高是否會(huì)導(dǎo)致IgE和FcεRIα的表達(dá)增高以及巨噬細(xì)胞活化，我們用免疫熒光/組織化學(xué)染色法檢測ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)IgE和FcεRIα的表達(dá)水平，結(jié)果顯示過敏性哮喘組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)IgE和FcεRIα的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；同時(shí)過敏性哮喘組小鼠血清IgE也較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。 與哮喘組比較，經(jīng)過8周的IL-4 mAb干預(yù)后，增高的IgE和FcεRIα表達(dá)水平被顯著抑制(P<0.05)，血清IgE水平也顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的改變

為了檢測小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的改變，我們還用real-time PCR檢測了巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)和IL-6 在小鼠脾臟的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示過敏性哮喘組小鼠的上述因子表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，即過敏性哮喘狀態(tài)下小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞活化程度有顯著增加。與哮喘組比較，用IL-4 mAb干預(yù)過敏性哮喘組小鼠8周后，巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子MCP-1、MIP1α和IL-6 在脾臟的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，即IL-4抑制狀態(tài)下巨噬細(xì)胞活化程度被顯著抑制，見圖4。

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化和過敏性哮喘的慢性炎癥都與CD4+T細(xì)胞亞群的失衡有關(guān)，以分泌IFN-γ為主的Th1細(xì)胞過度增殖，并進(jìn)一步活化如巨噬細(xì)胞等其它炎性細(xì)胞，是AS病變不斷進(jìn)展的重要機(jī)制[1-2, 14]；而過敏性哮喘則是免疫反應(yīng)向Th2型偏移所導(dǎo)致的[15]，盡管哮喘是一種異質(zhì)性疾病，但幾乎在所有類型哮喘患者的肺部都能檢測到有Th2細(xì)胞增多，尤其是在過敏性哮喘患者[16]?；罨腡h2細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞因子,如IL-4等，IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞合成變應(yīng)原特異性的IgE[17]，IgE進(jìn)一步上調(diào)并結(jié)合于效應(yīng)細(xì)胞表面的FcεR并活化靶細(xì)胞合成和分泌多種炎性介質(zhì)，從而導(dǎo)致炎癥不斷進(jìn)展[18-19]。但Th2和IL-4在AS的發(fā)生發(fā)展中的作用到目前為止依然是有爭議的，一些研究顯示IL-4對(duì)AS的發(fā)展有保護(hù)作用[20-21]，而另外一些研究則發(fā)現(xiàn)IL-4敲除可以抑制ApoE-/-小鼠的AS進(jìn)展[22]。

Figure 3. The changes of IgE and FcεRIα in the mice (×200). Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsasthma group.

圖3小鼠體內(nèi)IgE和FcεRIα表達(dá)水平的改變

Figure 4. The changes of the macrophage activation state in the mice. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsasthma group.

圖4小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的改變

在本研究中，我們觀察到過敏性哮喘可以加速ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)伴隨著體內(nèi)Th2細(xì)胞及其代表性細(xì)胞因子IL-4水平的顯著增高，提示我們過敏性哮喘對(duì)小鼠AS發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用可能與Th2細(xì)胞的增加有關(guān)；為了進(jìn)一步確定是否增高的Th2細(xì)胞和IL-4就是過敏性哮喘促進(jìn)AS不斷進(jìn)展的原因，我們用IL-4 mAb干預(yù)過敏性哮喘ApoE-/-小鼠8周，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈根部斑塊病變顯著減少，提示我們過敏性哮喘對(duì)小鼠AS病變的促進(jìn)作用確實(shí)是通過Th2細(xì)胞和IL-4水平增加而發(fā)揮作用的。

既往研究表明，IL-4可以誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE[23]，而IgE可以結(jié)合在巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的FcεR，進(jìn)而促進(jìn)炎癥過程的進(jìn)展[17-18]。而且，活化的FcεRI可以在如DCs細(xì)胞等影響IFN-γ介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，以及抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的血漿IgE水平顯著升高并且與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)，患者斑塊局部尤其是富含巨噬細(xì)胞區(qū)域的IgE及其受體FcεRI表達(dá)水平增高，并且在ApoE-/-FcεRIα-/-小鼠發(fā)現(xiàn)AS病變程度減輕，炎性細(xì)胞和炎性因子顯著減少；該小組的另一項(xiàng)研究也表明，IgE水平是糖尿病和糖尿病前期患者的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[25]；提示IgE和FcεR對(duì)人和小鼠AS的發(fā)生發(fā)展可能有促進(jìn)作用。因此，我們推測，過敏性哮喘狀態(tài)下小鼠體內(nèi)增加的Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-4可能是通過刺激B細(xì)胞合成和分泌大量的IgE，IgE進(jìn)一步上調(diào)和結(jié)合于巨噬細(xì)胞表面的FcεRI，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化并導(dǎo)致AS炎癥反應(yīng)加劇。

為了驗(yàn)證上述假設(shè)，我們檢測了IgE和FcεRIα在斑塊局部的表達(dá)水平，結(jié)果顯示IgE和FcεRIα的表達(dá)在過敏性哮喘ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊中是顯著增高的，然而在8周的IL-4 mAb干預(yù)后，其表達(dá)顯著降低；為了確認(rèn)巨噬細(xì)胞是否確實(shí)被活化，我們還進(jìn)一步檢測了巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MCP-1、 MIP1α和IL-6的mRNA表達(dá)水平在過敏性哮喘小鼠都顯著增高，說明過敏性哮喘狀態(tài)下巨噬細(xì)胞被激活，然而在8周的IL-4 mAb干預(yù)后上述炎癥因子的表達(dá)水平被顯著抑制，進(jìn)一步證實(shí)了我們的假設(shè)，即過敏性哮喘狀態(tài)下增高的Th2細(xì)胞和IL-4確實(shí)是通過IgE-FcεRIα交聯(lián)途徑激活巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致AS病變不斷進(jìn)展的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘可以促使ApoE-/-小鼠體內(nèi)Th2細(xì)胞和IL-4水平顯著增加，并進(jìn)一步通過IgE-FcεRIα交聯(lián)途徑激活巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致AS病變加速進(jìn)展。本研究為過敏性哮喘加速AS的機(jī)制增添了新的證據(jù)，并為其進(jìn)一步深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。