王進(jìn)峰， 舒文云， 祝宏斌， 鄺乾華

(浙江衢化醫(yī)院泌尿外科， 浙江 衢州 324004)

在男性群體中，前列腺癌是臨床上發(fā)病率占第二位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性健康和生活質(zhì)量[1-2]。目前，對(duì)于早期前列腺癌，手術(shù)切除腫瘤組織是臨床上最有效的治療方法，但對(duì)于中、晚期前列腺癌患者而言，由于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，患者需要進(jìn)行系統(tǒng)性化療以提高其生活質(zhì)量和生存率[3-4]。然而，很多患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物并不敏感，因此在化療過(guò)程中聯(lián)合一些輔助治療藥物提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性是改善抗腫瘤治療的重要策略。

順鉑(cisplatin)有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤作用，具有細(xì)胞毒性，是治療前列腺癌的常規(guī)化療藥物。順鉑在腫瘤細(xì)胞中能與DNA結(jié)合，引起交叉聯(lián)結(jié)，從而破壞DNA的功能，激活腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，使其發(fā)生凋亡性死亡[5-7]。然而順鉑的副作用較大，大劑量使用具有明顯的腎毒性和耳毒性，且隨著順鉑的持續(xù)使用，前列腺癌細(xì)胞會(huì)逐漸形成對(duì)順鉑的耐藥性[8-10]，因此采取輔助治療手段提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性具有十分重要的臨床意義。

二氫楊梅素(dihydromyricetin)又名蛇葡萄素，是一種具有很強(qiáng)藥理活性的黃酮類(lèi)化合物，具有解除醇中毒和抑制細(xì)胞惡變的作用，文獻(xiàn)報(bào)道二氫楊梅素還有一定的抗腫瘤活性[11-12]，然而其是否能增強(qiáng)順鉑的抗前列腺癌活性至今仍很少報(bào)道。本研究的目的在于探討二氫楊梅素對(duì)前列腺癌順鉑化療的輔助作用并研究其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞系PC3和LNCaP購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

順鉑、二氫楊梅素、MTT和凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco；蛋白提取液，以及抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1)、細(xì)胞色素C (cytochrome C)和GAPDH抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；線粒體分離試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠和FOXO1小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)購(gòu)于Santa Cruz；ECL顯色試劑盒購(gòu)于Pierce；Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen。

3 方法

3.1FOXO1基因沉默 將PC3細(xì)胞接種在6孔板中孵育過(guò)夜，使其貼壁。將50 nmol/LFOXO1 siRNA用Lipofectamine 2000進(jìn)行包裹后將其加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。吸取原6孔板中的培養(yǎng)基，并將上述含F(xiàn)OXO1 siRNA的無(wú)血清培養(yǎng)基加入到6孔板中。細(xì)胞孵育6 h后吸去無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。對(duì)照組細(xì)胞采用Lipofectamine 2000(含無(wú)關(guān)siRNA)孵育6 h。

3.2細(xì)胞活力的檢測(cè) 將常規(guī)PC3細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞和FOXO1基因沉默的PC3細(xì)胞按每孔5×103接種在96孔板中孵育過(guò)夜，后加入順鉑(0、1、2、5、10、15、20和30 μmol/L)和二氫楊梅素(0、5、10、50、100和200 μmol/L)處理細(xì)胞48 h，之后加入20 mL MTT(5 g/L)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL二甲亞砜，充分振蕩混勻后在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)。細(xì)胞活力結(jié)果用藥物處理組與對(duì)照組的A值比值表示。

3.3線粒體分離 轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理48 h后，用線粒體分離試劑盒按說(shuō)明所示步驟分離移除PC3細(xì)胞中的線粒體，收集無(wú)線粒體的細(xì)胞質(zhì)用以檢測(cè)其中的細(xì)胞色素C。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理48 h后，用蛋白提取液提取PC3細(xì)胞中的總蛋白。在等量的總蛋白質(zhì)中加入上樣緩沖液后用10% SDS-PAGE進(jìn)行分離。分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉孵育2 h。加入抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、Apaf-1、cytochrome C和GAPDH的 I 抗對(duì)PVDF膜進(jìn)行孵育過(guò)夜，后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

3.5免疫共沉淀 轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)處理48 h后，用蛋白提取液對(duì)PC3細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解后的細(xì)胞在12 000 r/min下離心10 min，收取上清液分成等量2份，一份直接進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照(input)，另外一份加入Apaf-1抗體孵育過(guò)夜，孵育完成后在該體系中加入蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠孵育2 h。之后在共沉淀產(chǎn)物中加入上樣緩沖液并煮沸除去瓊脂糖珠后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)與Apaf-1結(jié)合的caspase-9蛋白。

3.6細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)處理48 h后按說(shuō)明書(shū)步驟用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 15.0。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，行Bonferroni校正進(jìn)行多組間均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 二氫楊梅素顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷活性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二氫楊梅素單獨(dú)處理對(duì)PC3和LNCaP細(xì)胞的殺傷活性都較弱，見(jiàn)圖1A、B，然而較低濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理卻能顯著提高不同濃度順鉑(0～30 μmol/L)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC3和LNCaP的殺傷活性(P<0.05)，表明二氫楊梅素輔助治療能明顯增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,見(jiàn)圖1C、D。在對(duì)PC3的聯(lián)合治療中，二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合較低濃度順鉑(2 μmol/L)已能顯著殺傷腫瘤細(xì)胞，因此選擇該濃度藥物進(jìn)行機(jī)制研究。

Figure 1. Dihydromyricetin enhanced the cytotoxicity of cisplatin against prostate cancer cells. A: cytotoxicity of dihydromyricetin (0～200 μmol/L) against PC3 cells； B: cytotoxicity of dihydromyricetin (0～200 μmol/L) against LNCaP cells； C: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0～30 μmol/L) against PC3 cells； D: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0～30 μmol/L) against LNCaP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1二氫楊梅素增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷活性

2 二氫楊梅素提高順鉑對(duì)PC3細(xì)胞的殺傷活性依賴(lài)于FOXO1途徑

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二氫楊梅素能明顯誘導(dǎo)PC3細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)(P<0.05)，表明FOXO1是二氫楊梅素的作用靶點(diǎn),見(jiàn)圖2A。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,盡管二氫楊梅素輔助治療能明顯提高順鉑的抗前列腺癌活性，然而轉(zhuǎn)染FOXO1 siRNA后，二氫楊梅素對(duì)順鉑的協(xié)同作用受到明顯抑制(P<0.05)，提示二氫楊梅素通過(guò)上調(diào)前列腺癌細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)提高其對(duì)順鉑化療的敏感性，見(jiàn)圖2B。另外，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染FOXO1 siRNA后，兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的Noxa和Bim的過(guò)表達(dá)受到顯著抑制(P<0.05)，提示二氫楊梅素可能通過(guò)FOXO1-Noxa/Bim途徑促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的凋亡通路，見(jiàn)圖2C。

Figure 2. Dihydromyricetin-promoted death of cisplatin-treated PC3 cells was dependent on the FOXO1 pathway. A: dihydromyricetin decreased the expression of FOXO1 in PC3 cells; B:FOXO1 siRNA suppressed the promotion of dihydromyricetin on cisplatin-induced death of PC3 cells; C: combination of dihydromyricetin and cisplatin induced overexpression of Noxa and Bim in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.

圖2二氫楊梅素提高順鉑對(duì)PC3細(xì)胞的殺傷活性依賴(lài)于FOXO1途徑

3 二氫楊梅素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡

鑒于二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表達(dá)，本研究進(jìn)一步探討兩者聯(lián)合對(duì)PC3細(xì)胞凋亡通路的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二氫楊梅素聯(lián)合順鉑處理的PC3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白水平顯著升高(P<0.05)，表明二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞的細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中,見(jiàn)圖3A。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二氫楊梅素輔助治療能明顯促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的Apaf-1和caspase-9的相互作用(P<0.05),見(jiàn)圖3B。

在其下游凋亡信號(hào)通路中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二氫楊梅素聯(lián)合順鉑顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生caspase-9和caspase-3的活化(P<0.05),見(jiàn)圖3C,并最終導(dǎo)致其發(fā)生顯著的凋亡(P<0.05),見(jiàn)圖3D。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二氫楊梅素能通過(guò)FOXO1-Bim/Noxa途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。

討 論

二氫楊梅素是一種天然黃酮類(lèi)有效成分，具有抗氧化、抗血栓和抗炎作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素還具有一定的抗腫瘤活性，如二氫楊梅素能通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)抑制其轉(zhuǎn)移和侵襲能力[13]，又如二氫楊梅素能通過(guò)ROS-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)頭頸癌細(xì)胞的凋亡和自噬[14]，然而二氫楊梅素在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)活性及其對(duì)順鉑化療的協(xié)同效應(yīng)至今仍很少報(bào)道。順鉑是治療前列腺癌的重要化療藥物，研究表明順鉑能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[15]，然而順鉑的副作用較大，大劑量的使用具有明顯的腎毒性和耳毒性，且一些前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性較低，因此采取輔助治療手段降低順鉑的使用劑量并提高其抗腫瘤活性十分重要。

Figure 3. Combination of dihydromyricetin and cisplatin induced mitochondrial apoptosis in PC3 cells. A: dihydromyricetin promoted release of cytochrome C in cisplatin-treated PC3 cells; B: dihydromyricetin promoted the interaction of Apaf-1 and caspase-9 in cisplatin-treated PC3 cells; C: dihydromyricetin promoted cleavage of caspase-9 and caspase-3 in cisplatin-treated PC3 cells; D: dihydromyricetin significantly enhanced the cisplatin-induced apoptosis in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.

圖3二氫楊梅素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡

在本研究中，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素單獨(dú)治療對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷活性較弱，較高濃度仍不能達(dá)到理想的抗腫瘤效果。然而較低濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L)即能明顯增強(qiáng)各種濃度順鉑的抗前列腺癌活性，使較低濃度的順鉑(2 μmol/L)也能對(duì)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的殺傷活性，表明二氫楊梅素對(duì)前列腺癌的順鉑化療有協(xié)同效應(yīng)。

FOXO1是一個(gè)很重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞中各種生理活動(dòng)，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換遞進(jìn)和凋亡信號(hào)的傳遞。FOXO1已經(jīng)被證實(shí)是一種腫瘤抑制性分子，腫瘤細(xì)胞中FOXO1表達(dá)的缺失將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和惡性細(xì)胞的增殖[16-17]。此外，F(xiàn)OXO1還能增強(qiáng)一些下游促凋亡基因，如Noxa和Bim的轉(zhuǎn)錄活性，因此FOXO1的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[18-19]。本研究的機(jī)制性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二氫楊梅素能明顯提高前列腺癌細(xì)胞中FOXO1蛋白的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)了前列腺癌細(xì)胞中Noxa和Bim基因的轉(zhuǎn)錄活性，使腫瘤細(xì)胞在順鉑的治療下能發(fā)生Noxa和Bim的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞色素C的參與下，Apaf-1與caspase-9發(fā)生相互作用使之活化，再通過(guò)下游分子caspase-3的參與最終使前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。

綜上所述，本研究證明了二氫楊梅素能顯著增強(qiáng)順鉑的抗前列腺癌活性并研究了其機(jī)制。這些研究為提高化療藥物的臨床療效并降低其使用劑量提供了新的策略和思路。