陳穎詩， 張 旭， 彭治林， 羅海華， 張 輝， 張譯文

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

獲得性免疫，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，其重要特征之一是具有免疫記憶能力，即當(dāng)再次遇到同一抗原時，可迅速產(chǎn)生強烈的二次免疫應(yīng)答。在淋巴組織中，在外來抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞攝取加工后提呈給初始T細(xì)胞(naVve T cells, TN)的過程中，因T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)信號強度的差異，細(xì)胞分化發(fā)生變化[1]。在 T 細(xì)胞大量擴(kuò)增的過程中，大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，剩余約5%～10%左右的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃浶?T細(xì)胞，區(qū)別于TN，其表型為CD45RA-CD45RO+[2]。根據(jù)自我更新能力及免疫應(yīng)答能力的差異[3]，記憶性 T 細(xì)胞可再細(xì)分為中央記憶型T細(xì)胞(central memory T cells，TCM；表型為CD62L+CCR7+)及效應(yīng)記憶性 T細(xì)胞(effector memory T cells，TEM；表型為CD62L-CCR7-)。

當(dāng)前有效疫苗的研發(fā)都以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫記憶為前提。在腫瘤研究中，科學(xué)家們開發(fā)出一種可以有效抑制腫瘤的新方法，即將患者自身的記憶性T淋巴細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增改造重新注入患者體內(nèi)。這一療法為腫瘤治療帶來了新的曙光。然而對記憶細(xì)胞的分化機制及關(guān)于這些記憶性 T 細(xì)胞的形成、分化及維持規(guī)律仍存在很大的爭議[4]。這也是疫苗研制滯后的關(guān)鍵原因，解析其分化機制已成為疫苗研究的迫切需要解決的問題。目前已報道的記憶性T細(xì)胞擴(kuò)增方法大多是圍繞細(xì)胞因子的組合使用，在臨床上使用具有安全性和治療成本的限制[5]。

可的松是一類由腎上腺產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素，由于是脂溶性的小分子化合物，可通過結(jié)合其胞質(zhì)受體介導(dǎo)其生物效應(yīng)功能，進(jìn)而轉(zhuǎn)位至胞核，直接或間接調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[6]。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為糖皮質(zhì)激素通過抑制激活誘導(dǎo)基因的表達(dá)來對外周T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用。既往研究表明糖皮質(zhì)激素參與T細(xì)胞譜系的分化(尤其是CD4+Th1和Th2細(xì)胞)，并且能夠下調(diào)Fas配體的表達(dá)和抑制激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。已有文獻(xiàn)報道，糖皮質(zhì)激素的吸入可調(diào)節(jié)哮喘患兒外周血CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，與治療的效果相關(guān)[7]?；谔瞧べ|(zhì)激素在CD4+T淋巴細(xì)胞亞群生長分化中發(fā)揮的強大作用，而在CD8+T淋巴細(xì)胞中的研究較為欠缺，本研究試圖探索糖皮質(zhì)激素對人CD8+T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，并觀察糖皮質(zhì)激素在CD8+TCM誘導(dǎo)分化中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

健康人的外周成分血由廣州市血液中心提供。

2 主要試劑

人外周血淋巴細(xì)胞分離液 (天津市灝洋生物制品科技有限公司)； Human CD8 T Lymphocyte Enrichment Set-DM (BD Biosciences)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；流式細(xì)胞術(shù)用抗體APC-anti-CD8和Alexa Fluor 700-anti-CCR7 (BD Pharmingen)；PerCP-Cy5.5-anti-CD45RO和PE-Cy7-anti-CD62L (eBioscience)； ECD-anti-CD45RA(Beckman Coulter)。

3 主要儀器

生物安全柜(Thermo Fisher Scientific， MSC-ADVANTAGE)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific， HERAcell 150i)；離心機(Eppendorf, Centrifuge 5810R)；光學(xué)倒置生物顯微鏡(Leica)；細(xì)胞磁珠分選磁力架(BD Biosciences)；分選型流式細(xì)胞儀(BD， FACSAria cell sorter)；分析型流式細(xì)胞儀(BD, LSR Fortessa)；血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；20 mL注射器(北京頗賽科技發(fā)展有公司)。

4 主要方法

4.1人外周單個核細(xì)胞的分離 參考已報道的分離方法[5, 8-9]，取10 mL 正常人外周血加入到40 mL PBS+2 mmol/L EDTA+0.5% BSA溶液中，混勻。再取50 mL 離心管，加入25 mL 人淋巴細(xì)胞分離液。用吸管向小心貼著淋巴細(xì)胞分離液界面加入25 mL 混勻的外周血，避免破壞液面分層，20 ℃、400×g離心40 min，小心吸出中間乳白色層于新離心管中，并加入3～5 倍體積 PBS+ 2 mmol/L EDTA+5% BSA溶液稀釋，20 ℃、350×g離心15 min，棄上清液。PBS+2 mmol/L EDTA+5% BSA溶液重懸細(xì)胞，20 ℃、300×g離心7 min，棄上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)基定容至15 mL，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.2CD8+T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和激活 向得到的外周單個核細(xì)胞中加入CD8+T細(xì)胞陰選試劑盒中的I抗，室溫孵育15 min，讓細(xì)胞與抗體充分結(jié)合，300×g離心10 min。加入CD8+T細(xì)胞陰選試劑盒中的磁珠 II 抗孵育30 min；隨后進(jìn)行過柱細(xì)胞分選，得到CD8+T細(xì)胞。用適量PBS+2 mmol/L EDTA+5% BSA溶液重懸細(xì)胞，20 ℃、300×g離心7 min，棄上清液。用PBS+2 mmol/L EDTA+5% BSA溶液將細(xì)胞重懸至(50～80)×109/L，每 1×106個細(xì)胞加入1 μL 流式抗體，混勻，室溫孵育20 min。加入10倍體積的PBS，20 ℃、300×g離心7 min，棄上清液。加入PBS將細(xì)胞重懸至(8～10)×109/L，移入12×75 mm流式管，流式細(xì)胞儀分選出Na ?ve CD8+T細(xì)胞(CD8+CD45RO-CD62L+)。

將獲得的CD8+T細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞計數(shù)后，按照每孔2×105的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)在anti-CD3和anti-CD28預(yù)處理的48孔板中，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

用人anti-CD3(0.5 mg/L)的抗體提前處理48孔細(xì)胞培養(yǎng)板4 ℃靜置過夜，第 2天吸去細(xì)胞因子并用PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板。隨后將CD8+T細(xì)胞鋪于孔板中。每孔加入anti-CD28(1 mg/L)和IL-2(10 μg/L)培養(yǎng)48 h，激活CD8+T細(xì)胞。

4.3糖皮質(zhì)激素的添加 將已激活的CD8+T細(xì)胞分成實驗組和對照(negative control,NC)組，實驗組中氫化可的松(hydrocortisone, HC； 5 μmol/L和500 nmol/L)和醋酸可的松(cortisone acetate, CA； 1 μmol/L和100 nmol/L)各取2個濃度，對照組加入等體積的PBS。每隔2 d需要換1次液，同時補充加入1次細(xì)胞因子和可的松。

4.4細(xì)胞亞群的檢測和分析 在細(xì)胞培養(yǎng)的第0、7和14天，分別收取細(xì)胞標(biāo)記抗體(APC-anti-CD8、Alexa Fluor 700-anti-CCR7、PerCP-Cy5.5-anti-CD45RO、PE-Cy7-anti-CD62L和ECD-anti-CD45RA)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+TCM的比例。

4.5CFSE染色檢測細(xì)胞增殖 CD8+T細(xì)胞以2×1010/L的密度重懸于PBS緩沖液中，并加入終濃度為 1 μmol/L的CFSE，37 ℃下避光孵育15 min，此后加入10倍體積冷凍的RMPI-1640完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，300×g離心7 min后棄上清液。再加入10倍體積的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，冰浴5 min后，300×g離心7 min，重懸于適當(dāng)體積的RMPI-1640完全培養(yǎng)基備用。

4.6Annexin V檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，300×g離心7 min后棄上清液。加入PBS洗滌細(xì)胞，300×g離心7 min后棄上清液。加入1×Annexin V Binding Solution制備細(xì)胞終濃度為1×109/L的細(xì)胞懸液，取100 μL懸液到新管中，加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物，室溫下避光培養(yǎng)15 min。加入400 μL的1×Annexin V Binding Solution終止反應(yīng)， 并在1 h內(nèi)檢測。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

本設(shè)計所用的數(shù)據(jù)和圖片處理分析軟件為FlowJo 10.0 (Tree Star)、Adobe Photoshop CC (Adobe Systems Inc.)和GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc.)。采用SPSS 13.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。實驗組與對照組的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1流式細(xì)胞術(shù)分析檢測CD8+TCM方法的構(gòu)建

人外周血中CD4+和CD8+T 細(xì)胞均有穩(wěn)定存在的TCM。首先，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征圈定淋巴細(xì)胞群范圍，通過表面標(biāo)志確定CD8+T 細(xì)胞；然后，再圈定記憶細(xì)胞表型的表面分子為CD45RA-；最后，圈定TCM記憶表型的表面分子CCR7和CD62L。由于本次實驗采用的是健康人的樣本，所以未經(jīng)誘導(dǎo)的CD8+TCM占整群細(xì)胞的比例基本接近，總體來說比例較少，約占CD8+T 細(xì)胞的1%～3%，見圖1。

Figure 1. The gating strategy of human CD8+TCMand the natural proportion of CD8+TCMfrom healthy human peripheral blood sample. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gra-dient centrifugation. The PBMCs were labeled with indicated antibody and the proportion of CD8+TCMwas examined by flow cytometery. Firstly, CD8+T cells were gated (A)， and then the CD45RO+CD45RA-subset of all CD8+T cells were gated (B). After that, the CD62L+CCR7+cells were gated (C).

圖1人CD8+TCM分析策略及健康人外周血中CD8+TCM的比例分析

本研究首先采用密度梯度離心的方法分選出人外周血單個核細(xì)胞，接著用磁珠法將這些細(xì)胞中的CD8+T細(xì)胞分選出來，再通過分選型流式細(xì)胞儀獲得na ?ve CD8+T 細(xì)胞(CD8+CD45RO-CD62L+)。為了保證后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性，將分選所得的CD8+T細(xì)胞通過分析型流式細(xì)胞儀檢測純度，檢測結(jié)果如圖2所示，磁珠法分離出來的CD8+T細(xì)胞的比例為96.4%，滿足本研究后續(xù)實驗的需求。

2 糖皮質(zhì)激素對CD8+ TCM比例的影響

為了探究糖皮質(zhì)激素對人CD8+TCM的誘導(dǎo)作用，將分離的naVve CD8+T細(xì)胞進(jìn)行為期 14 d的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)CD8+TCM的擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測。從流式圖中明顯觀察到實驗組中，醋酸可的松在0.1 μmol/L濃度處理后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+TCM比例為16.4%，在1 μmol/L濃度處理后產(chǎn)生的CD8+TCM比例為41.3%；而氫化可的松在0.5 μmol/L濃度處理后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+TCM比例為41.6%，在5 μmol/L濃度處理后產(chǎn)生的CD8+TCM比例為20.3%，相對于對照組 (6.39%)的擴(kuò)增比例明顯抬高，見圖3A。本實驗一共重復(fù)了6個健康人的細(xì)胞樣本，對每一例樣本檢測后，具體的統(tǒng)計結(jié)果如圖3B所示。通過6組樣品數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，氫化可的松化合物進(jìn)行誘導(dǎo)時隨濃度增大擴(kuò)增效率反而降低，相反醋酸可的松則表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。

Figure 2. The purity of human naVve CD8+T cells. Among the isolated PBMCs, na ?ve CD8+T cells were further isolated with MACS microbeads and flow cytometry. The naVve CD8+T cells were labeled with indicated antibody and the purity was examined by flow cytometery. Na ?ve CD8+T cells were defined as CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L+CCR7+.

圖2人naVveCD8+T細(xì)胞純度的檢測

Figure 3. Glucocorticoids induced the formation of CD8+TCMfrom naVve precursors. The representative flow cytometry results from single experiment (A) and the quantitative analysis of the proportions (B) were showed. NC: negative control； CA: cortisone acetate； HC: hydrocortisone. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖3糖皮質(zhì)激素對CD8+TCM擴(kuò)增的影響

3 糖皮質(zhì)激素對CD8+ TCM增殖的影響

為了進(jìn)一步確定糖皮質(zhì)激素是否對CD8+T細(xì)胞的增殖有影響，本實驗采用低毒性的細(xì)胞追蹤染料CFSE來初步探究相關(guān)的增殖狀況。本實驗中將分選得到的naVve CD8+T細(xì)胞進(jìn)行CFSE染色，然后將染色后細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)，加入對應(yīng)濃度的糖皮質(zhì)激素，培養(yǎng)至第3和第6天時用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示實驗組和對照組細(xì)胞在第3天和第6天增殖情況的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。第3天各組內(nèi)約40%～50%的細(xì)胞處于分裂增殖狀態(tài)，第6天約60%的細(xì)胞處于分裂增殖狀態(tài)，表明這2種藥物并不抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖。

4 糖皮質(zhì)激素對CD8+ T細(xì)胞的凋亡作用

為了探究糖皮質(zhì)激素對CD8+T細(xì)胞是否具有藥物毒性而引起細(xì)胞凋亡，我們將分選得到的naVve CD8+T細(xì)胞用anti-CD3和anti-CD28雙信號完全模擬體內(nèi)的激活，將不同濃度的糖皮質(zhì)激素加入到每個樣本孔內(nèi)，培養(yǎng)14 d后取1×105細(xì)胞經(jīng)Annexin V染色，流式細(xì)胞技術(shù)檢測淋巴細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)14 d后，與對照組相比，凋亡細(xì)胞所占的比例差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明糖皮質(zhì)激素不影響CD8+T細(xì)胞的凋亡，見圖5。綜合上述結(jié)果，糖皮質(zhì)激素(包括醋酸可的松和氫化可的松)可在體外誘導(dǎo)CD8+TCM的形成，并且不影響細(xì)胞的增殖與凋亡，是可用于臨床誘導(dǎo)擴(kuò)增CD8+TCM的低毒小分子化合物。

討 論

細(xì)胞過繼治療是目前腫瘤治療的有效手段之一，通過將具有靶向特定殺傷性能的淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，達(dá)到特異性治療的效果。然而，從目的細(xì)胞篩選、擴(kuò)增到輸入體內(nèi)，耗時較長；再者，這些細(xì)胞在體內(nèi)存活時間短，容易向下游分化而失去治療有效性。為解決這些局限，以下幾點亟待解決：(1)獲得靶向性及殺傷能力更強的淋巴細(xì)胞；(2)優(yōu)化細(xì)胞的體外擴(kuò)增方案，在短時間內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量的細(xì)胞數(shù)；(3)改善回輸細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，維持細(xì)胞的自穩(wěn)定狀態(tài)。自TCM亞群發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的過繼性免疫療法中占絕對優(yōu)勢，在小鼠和靈長類動物腫瘤模型中取得了良好的抗瘤活性。同時也有證據(jù)表明相對于效應(yīng)記憶性T淋巴細(xì)胞，TCM不但具有更強的抗腫瘤能力[10-11]，而且還具有更強的增殖和自我更新能力，被認(rèn)為是未來 T 細(xì)胞過繼治療的新方向。

Figure 4. Glucocorticoids maintained the proliferation of CD8+T cells. The representative flow cytometry results from single experiment (A) and the quantitative analysis of the proportions (B) were showed. NC: negative control； CA: cortisone acetate； HC: hydrocortisone. Mean±SD.n=3.

圖4糖皮質(zhì)激素對CD8+T細(xì)胞增殖的影響

對于糖皮質(zhì)激素，此前的研究都聚焦于其對免疫系統(tǒng)的抑制作用，提出其在生理濃度就足以誘導(dǎo)CD4+或CD8+T細(xì)胞和DC細(xì)胞的凋亡。但由于外周T細(xì)胞表達(dá)一定量的抗凋亡分子Bcl-2，故對糖皮質(zhì)激素的耐受相對較高。本實驗前期通過高通量藥物篩選，發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素在一定程度上可以促進(jìn)CD8+TCM的分化，這使得我們對其認(rèn)識不斷完善。之前的也有類似的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中證實糖皮質(zhì)激素有助于誘導(dǎo)分泌IL-4的T細(xì)胞(即Th2細(xì)胞)分化，然而由于物種差異，人與小鼠則截然不同，糖皮質(zhì)激素抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可能由于人和小鼠細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的易感性差異所致。

本研究初步探索了體外擴(kuò)增CD8+TCM的新方法，主要從淋巴細(xì)胞表型、化合物作用下的細(xì)胞增殖和凋亡作用3個層面進(jìn)行研究，首次發(fā)現(xiàn)一定濃度的糖皮質(zhì)激素類藥物在體外可以有效擴(kuò)增人CD8+TCM。通過設(shè)置不同的濃度梯度發(fā)現(xiàn)，適中濃度的糖皮質(zhì)激素，如醋酸可的松在1 μmol/L、氫化可的松在0.5 μmol/L可表現(xiàn)出對CD8+TCM的良好擴(kuò)增效果；同時，糖皮質(zhì)激素對來源于人外周血的CD8+T細(xì)胞具有維持增殖的作用，細(xì)胞毒性極低，不會引起淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)的凋亡。

綜上所述，作為已廣泛用于臨床的藥物，糖皮質(zhì)激素是一類安全有效的小分子化合物。利用糖皮質(zhì)激素在體外擴(kuò)增CD8+TCM的方法安全性較高，擴(kuò)增效果明顯，不僅革新了人們對于糖皮質(zhì)激素的傳統(tǒng)認(rèn)識，而且還推動了免疫細(xì)胞的體外擴(kuò)增技術(shù)，為后續(xù)抗病毒和抗腫瘤的細(xì)胞過繼免疫治療的廣泛開展提供了一個全新的參考方案。

Figure 5. Glucocorticoids prevented the apoptosis of activated naVve CD8+T cells. The representative flow cytometry results from single experiment (A) and the quantitative analysis of the proportions (B) were showed. NC: negative control； CA: cortisone acetate； HC: hydrocortisone. Mean±SD.n=3.

圖5糖皮質(zhì)激素對CD8+T細(xì)胞凋亡的影響