林志國(guó)， 劉 佳， 杜 娟， 劉振艷， 彭 瑤， 皮秀杰， 王玉鳳， 戰(zhàn)文娜， 李德海， 劉 穎， 鄧志會(huì)△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 2附屬第二醫(yī)院藥劑科, 3醫(yī)藥科學(xué)研究院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

Anterior gradient 2(AGR2)基因是一種具有進(jìn)化保守性的基因，最先在非洲蟾蜍中發(fā)現(xiàn)，局部性表達(dá)在原腸胚形成晚期背外胚層前部[1]。人和小鼠的AGR2主要在內(nèi)胚層來(lái)源的器官組織中表達(dá)，如肺、氣管、胃、結(jié)腸、小腸和前列腺等[2]。根據(jù)序列同源比對(duì)，AGR2屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的成員，該家族蛋白對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白中二硫鍵的正確連接具有重要作用[3]。研究表明，AGR2基因是原癌基因，在多種上皮腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等，并與腫瘤的發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與聚集、細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，同時(shí)可識(shí)別錯(cuò)誤的蛋白折疊，通過(guò)蛋白酶體途徑將其降解而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞正常功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是一些理化因素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊障礙，造成未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的堆積，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列自我保護(hù)適應(yīng)性反應(yīng)[5]。目前研究表明，ERS在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及凋亡中發(fā)揮著重要作用[6]。毒胡蘿卜素(thapsigargin)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣ATP酶結(jié)合，致使鈣不能通過(guò)鈣泵進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣儲(chǔ)量，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能引起ERS，是一種常用的細(xì)胞ERS誘導(dǎo)劑[7]。本研究以肺癌細(xì)胞系NCI-H460為模型，通過(guò)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)ERS，觀察AGR2對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討AGR2在肺癌發(fā)生發(fā)展以及藥物抵抗等方面可能發(fā)揮的作用，為AGR2作為肺癌診療的分子靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細(xì)胞NCI-H460和人腎上皮細(xì)胞293T均購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。RPMI-1640、DMEM和OPTI-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清購(gòu)自Clark Bioscience；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)和毒胡蘿卜素購(gòu)自Sigma；Annexin V-FITC熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自BD Bio-science；抗AGR2小鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)購(gòu)自Polysciences；引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1shRNA慢病毒介導(dǎo)的AGR2基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系的建立 (1)靶向AGR2基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)在線設(shè)計(jì)軟件(http://sirna.wi.mit.edu/)根據(jù)AGR2基因序列設(shè)計(jì)2組針對(duì)人AGR2基因的特異性shRNA序列以及對(duì)照shRNA(shControl)序列。shControl為5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’；shAGR2(A)為5’-GCCGATATCACTGGAAGATAT-3’；shAGR2(B)為5’-CCTTGAGACTTGAAACCAGAA-3’。通過(guò)DNA連接酶將合成的雙鏈DNA連接至線性化載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stable 3感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選出重組陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序鑒定。(2)shRNA慢病毒的包裝及篩選：以PEI為轉(zhuǎn)染試劑，將鑒定正確的慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔?psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染3 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，0.45 μm濾器過(guò)濾，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。胰酶消化處于?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460細(xì)胞接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后加入1 mL病毒液和介導(dǎo)慢病毒轉(zhuǎn)染的終濃度為8 mg/L的polybrene。病毒感染24 h后更換含2 mg/L嘌呤霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，進(jìn)行陽(yáng)性篩選，1周后得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆。 (3)Western blot檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系中AGR2蛋白的表達(dá)：收集各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取30 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，常規(guī)Western blot操作、ECL發(fā)光并于AI600多功能成像系統(tǒng)(GE Heathcare)中成像，并進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目標(biāo)條帶的表達(dá)變化。

2.2集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。每組取1.5×106個(gè)細(xì)胞接種于6 cm皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后，分別更換含有1 μmol/L的毒胡蘿卜素藥物培養(yǎng)基作用24 h。0.25%胰蛋白酶消化各組加藥處理過(guò)的細(xì)胞，利用Cellometer Mini自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔500個(gè)的細(xì)胞數(shù)分別接種于6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。用PBS稀釋甲醇配制的0.5%結(jié)晶紫至0.1%，染色15 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，肉眼直接計(jì)數(shù)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC/PI雙染法)檢測(cè)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞80%融合時(shí)加入5 μmol/L的毒胡蘿卜素作用24 h，然后分別收集各組上清和0.25%胰酶消化后的各組細(xì)胞于離心管中。預(yù)冷的PBS充分洗滌收集的細(xì)胞(4 ℃、1 800×g，5 min)， 100 μL結(jié)合緩沖液(0.01 mol/L pH 7.4 HEPES、0.14 mol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞并使其濃度為1×109/L；向各個(gè)細(xì)胞懸液樣品中加入5 μL Annexin V-FITC和2 μL的PI(100 mg/L)溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min；每管樣品中加入 400 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻后放置冰上，流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣品檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異的比較進(jìn)行單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Western blot檢測(cè)AGR2蛋白的表達(dá)

收集篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Wes-tern blot檢測(cè)AGR2的蛋白表達(dá)，以目的蛋白AGR2與GAPDH條帶的灰度比值代表AGR2蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與shControl組細(xì)胞相比，shAGR2(A)和shAGR2(B)組基因沉默細(xì)胞中AGR2蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖1，表明AGR2基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2 毒胡蘿卜素對(duì)AGR2基因沉默細(xì)胞增殖能力的影響

在未加藥處理時(shí)，與shControl對(duì)照細(xì)胞相比，2組AGR2基因沉默細(xì)胞的集落形成數(shù)沒(méi)有明顯的變化,見(jiàn)圖2A；而在毒胡蘿卜素作用24 h后，shAGR2(A)和shAGR2(B)組基因沉默細(xì)胞的集落形成數(shù)和shControl細(xì)胞相比明顯減少，見(jiàn)圖2B(P<0.05)。這些結(jié)果表明AGR2基因缺失不影響正常條件下NCI-H460細(xì)胞的增殖能力，但在毒胡蘿卜素作用下能夠顯著地降低細(xì)胞的增殖能力。

Figure 1. Establishment ofAGR2 gene konckdown cell line. Western blot was used to detect AGR2 expression in stable cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

圖1AGR2基因沉默細(xì)胞系的建立

Figure 2. The effect ofAGR2 gene knockdown on proliferation ability of NCI-H460 cells detected by colony formation assay in the absence or presence of thapsigargin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖2AGR2基因缺失對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖能力的影響

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGR2對(duì)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

在未加藥物處理時(shí)，各組細(xì)胞的凋亡率(Anne-xin V陽(yáng)性率)很低，均在5%以內(nèi)，且各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見(jiàn)圖3A；在毒胡蘿卜素作用各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系24 h后，shAGR2(A)和shAGR2(B)細(xì)胞凋亡率較shControl明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。這表明AGR2基因缺失使NCI-H460細(xì)胞對(duì)毒胡蘿卜素的作用更為敏感，凋亡率提高。

Figure 3. The effect ofAGR2 gene knockdown on apoptosis of NCI-H460 cells detected by flow cytometry in the absence or presence of thapsigargin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖3AGR2缺失對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響

討 論

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的的惡性腫瘤之一。發(fā)病率在中國(guó)呈上升和年輕化趨勢(shì)，其死亡率居各類腫瘤的第一位。然而，肺癌的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，肺癌細(xì)胞易于增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等機(jī)制尚未闡明。本項(xiàng)目通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA建立AGR2基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系，在毒胡蘿卜素誘導(dǎo)ERS后，我們發(fā)現(xiàn)AGR2能夠增強(qiáng)肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)降低其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明在ERS條件下，AGR2具有促增殖以及抗凋亡能力，在肺癌的發(fā)生發(fā)展、藥物抵抗中可能發(fā)揮重要作用。

AGR2在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，特別是肺腺癌中高表達(dá)。Fritzsche等[8]研究顯示，AGR2在66.3%的非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)；Pizzi等[9]通過(guò)免疫組化研究表明，在人肺腺癌組織中有30%病例AGR2為中度表達(dá)，70%為高度表達(dá)；而在人肺鱗癌中55%病例不表達(dá)AGR2，33%為弱表達(dá)，12%為中度表達(dá)。前期研究還顯示肺腺癌病人血清AGR2的水平顯著高于非腫瘤對(duì)照人群，且血清AGR2水平增高與手術(shù)后復(fù)發(fā)和不良預(yù)后顯著相關(guān)[9]。我們檢測(cè)了5種人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)GR2的表達(dá)情況，包括小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446以及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299、A549(肺腺癌細(xì)胞)、NCI-H460(大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、NCI-H226(肺鱗癌細(xì)胞)，其中只有NCI-H460細(xì)胞中AGR2高表達(dá)(結(jié)果未顯示)。本研究以AGR2高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460為模型，通過(guò)靶向AGR2基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、病毒的包裝和篩選，建立AGR2基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系，與對(duì)照細(xì)胞系相比AGR2蛋白表達(dá)下降90%以上。為深入研究原癌基因AGR2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將來(lái)還需要在其它高表達(dá)AGR2的肺癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證性研究。

AGR2基因作為一種原癌基因具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移以及增加細(xì)胞存活的能力，但分子機(jī)制不十分清楚。AGR2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)組織蛋白酶B和D的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。AGR2在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、雌激素受體和存活素的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[11]。Dong等[12]研究顯示AGR2通過(guò)影響Hippo通路YAP1在細(xì)胞核內(nèi)的定位調(diào)控雙調(diào)蛋白(amphiregulin，AREG)的表達(dá)，而AREG是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的配體，繼而激活A(yù)KT磷酸化促進(jìn)肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖；同時(shí)發(fā)現(xiàn)AGR2與EGFR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)相互結(jié)合，促進(jìn)其成熟使之轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，調(diào)控EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。研究還發(fā)現(xiàn)AGR2可以與低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)結(jié)合，AGR2表達(dá)增多可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性而延遲其在蛋白酶體的降解，促進(jìn)氯化鈷誘導(dǎo)的新霉素耐藥性，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活[14]。AGR2還參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移[15]。我們的研究結(jié)果顯示AGR2能夠促進(jìn)毒胡蘿卜素作用下的肺癌細(xì)胞抗凋亡及增強(qiáng)存活的能力，具體的分子機(jī)制可能與上述提及的Hippo、EGFR-AKT及HIF-1α等通路相關(guān)。

研究表明，AGR2既分布在細(xì)胞內(nèi),又分布在細(xì)胞外。AGR2是一種分泌型蛋白，細(xì)胞外AGR2與細(xì)胞膜受體C4.4A相互作用[2]，AGR2-C4.4A單克隆抗體能夠降低胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而提高胰腺癌細(xì)胞異種移植小鼠的存活率[16]。最新研究結(jié)果顯示，細(xì)胞外AGR2與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2結(jié)合，并促進(jìn)這些因子的同二聚體形成而使其活性增加，AGR2單克隆抗體能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及成纖維細(xì)胞的纖維化[17]。AGR2也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，其羧基端具有KTEL序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)KDEL樣受體結(jié)合，使其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)并維持其穩(wěn)定[18]；在ERS條件下促進(jìn)AGR2表達(dá)并參與胰腺癌的早期發(fā)生[19]。AGR2與ERS反應(yīng)關(guān)鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78相互作用，維持ERS反應(yīng)通路的活化，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力[20]。我們的研究結(jié)果顯示AGR2可以促進(jìn)ERS狀態(tài)下NCI-H460細(xì)胞的增殖以及抗凋亡作用。盡管這些結(jié)果不能說(shuō)明AGR2發(fā)揮功能的具體途徑，但提示AGR2能夠在ERS狀態(tài)下促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定，有利于腫瘤細(xì)胞在復(fù)雜的生長(zhǎng)微環(huán)境中生長(zhǎng)以及在抗腫瘤藥物作用下的存活，進(jìn)一步證實(shí)AGR2在肺癌發(fā)生發(fā)展及藥物抵抗中發(fā)揮的重要作用，為AGR2作為肺癌早期診斷、治療、藥物研發(fā)新的分子靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。