王利平，席冬梅，熊和麗，李國治，李 鵬，鄧衛(wèi)東*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.新鄉(xiāng)學院 生命科學與技術(shù)學院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

SLC11A1基因，又名天然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白1基因(NRAMP1)，編碼一種跨膜蛋白，定位于巨噬細胞晚期吞噬溶酶體的膜中，該基因是主要的自然抗性相關(guān)候選基因，與多種胞內(nèi)寄生病原菌的抵抗作用相關(guān)[1-3]。研究表明，SLC11A1蛋白除了對小鼠的后天獲得性免疫有影響外，在小鼠先天免疫中也起著關(guān)鍵性的作用，可促進巨噬細胞的細菌殺傷作用[4-6]。水牛、瘤牛、黃牛以及荷斯坦牛中，SLC11A1基因與布魯氏菌病、乳腺炎等一些疾病的抗性有關(guān)[7-11]；SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的多態(tài)性與對抗或易感布魯氏菌、牛分枝桿菌和禽分枝桿菌有關(guān)[12-16]，相關(guān)研究主要集中在SLC11A1基因3′UTR區(qū)的GT重復(fù)多態(tài)性上[7,17-19]。

中甸犏牛由中甸牦牛與迪慶黃牛雜交而成，表現(xiàn)出很強的雜種優(yōu)勢[20]。中甸犏牛作為青藏高原地區(qū)特有的重要肉乳兼用牛種，是農(nóng)牧民生產(chǎn)肉、酥油、奶渣等生活必需品的重要原料來源，特別適應(yīng)中國云南省海拔3 000 m以上環(huán)境惡劣的青藏高原[21]。

目前，關(guān)于中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)位點研究尚未見報道。為此，本研究首次克隆了中甸犏牛SLC11A1基因并擴增出3′UTR區(qū)序列，檢測其多態(tài)性，評價了其變異與抗病性的關(guān)系，以期為中甸犏牛的抗病育種提供輔助選擇的分子標記，為進一步研究SLC11A1基因多態(tài)性對動物機體的抗病性影響提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在中國云南省迪慶州香格里拉中甸屠宰場采集114份中甸犏牛肝臟樣品，迅速放置-20 ℃冰箱，用于下一步的試驗研究。

1.2 主要儀器與試劑

TG16-WS臺式高速離心機為上海盧湘儀離心機儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品，LifeECO基因擴增儀為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀購自上海培清科技有限公司。肝臟DNA組提取試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品，2×Easy PCR Super Mix、DNA Marker均購自北京碩擎生物技術(shù)有限公司。

1.3 犏?；蚪MDNA的提取

采用北京全式金公司的DNA提取試劑盒提取肝臟基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增及測序檢測核苷酸變異和3個GT重復(fù)多態(tài)位點

參考NCBI上牛SLC11A1基因序列(U12862)設(shè)計引物[22]，上游引物序列為：5′-GCCACGGGTGGAATGAGT-3′；下游引物序列為：5′-TGAGCTAGGAAATAGCAGG-3′，引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成。以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增出犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)276 bp長度的片段(對應(yīng)于U12862核苷酸位點1 738—2 013)。25 μL的PCR反應(yīng)體系含2×Easy PCR Super Mix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,DNA模板2 μL,上游引物(10 pmol/L) 1 μL；下游引物 (10 pmol/L) 1 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送昆明碩擎生物技術(shù)公司進行雙向測序。

1.5 統(tǒng)計分析

用在線軟件Shesis(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm) 統(tǒng)計3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點(MS1、MS2和MS3)的等位基因、基因型頻率和連鎖不平衡值(D′和r2)，并構(gòu)建主要多態(tài)位點的單倍型。用PopGen 32軟件計算期望雜合度(Exp_Het)和期望純合度(Exp_Hom)、觀察雜合度(Obs_Het)和觀察純合度(Obs_Hom)、卡方值(χ2)、哈迪-溫伯格值(Hardy-Weinberg，HW)、基因多樣性指數(shù)(Nei)和多態(tài)信息含量(PIC)，應(yīng)用Clustalx 1.83程序進行序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 中甸牦牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點等位基因及其頻率

在檢測到的3個多態(tài)位點中，MS1位點包含GT10、GT12、GT14、GT15、GT16、GT17共6個等位基因。MS2位點有GT5、GT6、GT7共3個等位基因。MS3位點有GT12、GT13、GT14、GT15、GT16共5個等位基因。GT15、GT5、GT13分別是這3個位點頻率最高的等位基因，頻率分別為0.284、0.685、0.433(圖1)。

2.2 中甸牦牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點基因型和基因型頻率

通過對114份犏牛肝臟樣品SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)雙向測序檢測到MS1位點有16個基因型，MS2位點有5個基因型，MS3位點有12個基因型。基因型GT12/15、GT5/5、GT13/13分別是這3個多態(tài)位點頻率最高的基因型，頻率依次為0.204、0.500、0.324(圖2)。

圖1 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)等位基因

圖2 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)基因型及基因型頻率

MS1位點有6個等位基因和16個基因型，基因型GT12/12是黃牛頻率最高的基因型被報道過，曾命名為NRAMP1.1或A[9,23]。研究證實，基因型GT12/12與抵抗牛布魯氏桿菌抗性有關(guān)，其他雜合基因型與易感性有關(guān)[9,14]。此外，在MS1位點首次發(fā)現(xiàn)了GT10、GT17基因型。MS2位點有3個等位基因和5個基因型，基因型GT5/5頻率最高，這個多態(tài)位點也是第一次被研究。MS3位點有5個等位基因和12個基因型，GT13和GT13/13分別是頻率最高的等位基因和基因型，與以前的研究一致[8,17,24]。荷斯坦牛中GT13/13基因型頻率是100%，并且該基因型與抵抗布魯氏桿菌抗性有關(guān)[8,25]。瘤牛、瘤牛與黃牛的雜交牛中均發(fā)現(xiàn)了GT13，可能與牧場人為的雜交育種、基因遷移、選擇育種有關(guān)[24]，也可能與水牛和黃牛中SLC11A1基因較高的mRNA的轉(zhuǎn)錄率和穩(wěn)定表達量有關(guān)[12-13,26]。

2.3 中甸牦牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點單倍型構(gòu)建和單倍型頻率

3個多態(tài)位點間共構(gòu)建出44個單倍型，GT12/5/13、GT16/5/13和GT15/5/13是頻率較高的單倍型，頻率依次為0.130、0.115、0.086。除此之外，還有其他7個單倍型GT15/6/14、GT17/6/14、GT15/5/12、GT15/5/14、GT16/5/12、GT16/5/14、GT14/6/14頻率高于或等于0.030(圖3)。同時對MS1和MS2位點也進行了單倍型構(gòu)建，共構(gòu)建出24個單倍型，GT12/13、GT12/14、GT14/15是頻率較高的單倍型，頻率依次為0.148、0.034、0.053，除此之外，還有其他有8個單倍型GT15/12、GT15/13、GT15/14、GT15/15、GT16/13、GT16/14、GT17/13、GT17/14頻率高于0.03(圖4)。

圖3 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點(MS1、MS2、MS3)構(gòu)成的單倍型頻率

圖4 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)2個多態(tài)位點(MS1與MS3)構(gòu)成的單倍型頻率

2.4 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位點多態(tài)信息參數(shù)

MS1、MS2、MS3 多態(tài)位點的多態(tài)信息含量從MS3的0.397到MS1的0.754不等，基因多樣性指數(shù)最小的是MS2位點，為0.456，最大的是MS1位點0.789。觀察純合度從MS1的0.296到MS3的0.620，觀察雜合度從MS3的0.380到MS1的 0.704，期望雜合度從MS2的0.458到MS1的 0.793(圖5)。利用在線軟件Shesis對3個位點進行兩兩位點的D′和r2的計算，對位點間連鎖緊密程度進行度量，位點MS1與MS2、MS1與MS3、MS2與MS3的D′值分別是0.332、0.337、0.355，r2值分別是0.023、0.026、0.044。多態(tài)位點MS1中雜合基因型的頻率為0.704、MS2中純合基因型的頻率為0.602、MS3中純合基因型的頻率為0.620。

多態(tài)位點MS1、MS3都有較高的多態(tài)變異性，MS2多態(tài)水平較低。MS1的雜合度較高與多態(tài)信息含量一致?？赡苁且驗橹械殛Ｉ钤谇嗖馗咴貐^(qū)，自由放牧，選擇壓力較低，采樣群體數(shù)量有限有關(guān)，與以前對哥倫比亞克里奧爾牛的研究結(jié)果一致[27-28]。D′和 r2值說明這3個多態(tài)位點的任何2個之間都存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

圖5 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)位點

2.5 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)3個多態(tài)位基因型和其他牛種抗性基因型的比較

通過與其他品種牛[9,14-15,25]SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)與疾病相關(guān)的基因型(MS1的GT12/GT12和MS3的GT13/GT13)的χ2比較分析發(fā)現(xiàn)，中甸犏牛與婆羅門瘤?！敛继m科牛、荷斯坦?！敛继m科牛、布蘭科牛、非洲牛的GT12/12基因型頻率差異顯著(P<0.01)；中甸犏牛與西班牙黃牛、荷蘭牛的GT13/13基因型頻率差異顯著(P<0.01)，與非洲牛差異不顯著(P>0.05)(表1、表2)。可見，中甸犏牛MS1的GT12/12和MS3的GT13/13基因型與抗病性有關(guān)。

表1 中甸犏牛多態(tài)位點MS1的同質(zhì)基因型GT12/12與其他品種牛相對應(yīng)基因型的χ2檢驗結(jié)果

表2 中甸犏牛多態(tài)位點MS3的同質(zhì)基因型GT13/13與其他品種牛相對應(yīng)基因型的χ2檢驗結(jié)果

2.6 犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)核苷酸變異

本研究除了檢測到犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)的GT重復(fù)多態(tài)外，在15頭犏牛中還發(fā)現(xiàn)了在核酸序列1 782位點處有堿基T→G轉(zhuǎn)換突變，在42頭犏牛中發(fā)現(xiàn)1 805位點處有堿基G→A的突變，在10頭犏牛中發(fā)現(xiàn)1 907位點處有堿基G→T的突變(圖6)。

圖6 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)位點(MS1、MS2、MS3)及其堿基突變位點

包含3個多態(tài)位點及核苷酸位點變異的犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)的7種比較典型的單倍型已提交GenBank注冊，登錄號分別是MH376753、MH376754、MH376755、MH376756、MH376757、MH376758、MH376759。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同品種牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)位點和等位基因不同

本研究擴增了中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)1 738—2 013長度為276 bp的堿基片段，發(fā)現(xiàn)了3處分別以位點1 781、1 874、1 908(位點參照GenBank登錄號U12862)為起始點的微衛(wèi)星多態(tài)MS1、MS2、MS3(圖6)。Kumar 等[24]擴增過此區(qū)域1 814—1 988長度為175 bp的序列，并檢測到從1 908位點開始的多態(tài)位點MS3有GT13—16重復(fù)4個基因型。Borriello等[12]在水牛上也擴增過此區(qū)域1 745—1 955長度為211 bp的序列，3個多態(tài)位點分別開始于1 781、1 876、1 912位點(參照GenBank登錄號U27105)，并依據(jù)這3個位點所有GT重復(fù)總數(shù)分為2個單倍型，A(33個GT重復(fù))和B(36個GT重復(fù))。Martinez等[14]擴增出了水牛1 745—1 955長度為211 bp的序列，檢測到等位基因4個單倍型(DQ095780、DQ095781、DQ376109、DQ376110)。Ganguly等[29]擴增出水牛1 804—1 996序列，并檢測到從1 912位點開始的GT13—16重復(fù)4個基因型。

3.2 不同品種牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)位點核苷酸變異不同

本研究中1 782位點的堿基T→G轉(zhuǎn)換突變和1 805位點處的堿基G→A的突變和以前在黃牛中的研究一致[23]。1 907位點處的堿基G→T突變是首次在中甸牦牛中發(fā)現(xiàn)的。1 782位點如果是堿基G，GT數(shù)量不會增加;如果是T堿基，GT重復(fù)數(shù)就增加1個。1 805位點如果是A堿基，整個GT數(shù)目會減少4個。雖然這些核苷酸變異的功能尚未明確，總體上，SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)變異與對病原微生物易感或抗性的關(guān)系已經(jīng)被多次研究[12,25,30-33]，這些多態(tài)位點的定位對于研究多態(tài)性與抗病性的關(guān)系具有重要的理論和實際指導意義。

3.3 中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)位點與抗性的關(guān)聯(lián)

在黃牛、瘤牛、水牛及其他反芻動物品種中都研究過SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)的多態(tài)性[7-9,11-4,18-19,23,25,34]。Borriello等[12]報道水牛中SLC11A1 AA基因型 (33GTs, DQ095780)對布魯氏桿菌易感。Barthel等[26]報道，黃牛中含有GT13轉(zhuǎn)染的細胞SLC11A1蛋白的表達量較含有GT16的高，從而限制了布魯氏桿菌的增殖。在水牛中研究發(fā)現(xiàn)，含有GT13的牛能顯著提高巨噬細胞的功能[29]。山羊中也發(fā)現(xiàn)了SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)的2個多態(tài)位點A和B, 并且發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與布魯氏桿菌感染有關(guān)聯(lián)[18]。Abraham 等[19]對山羊的研究發(fā)現(xiàn)，221～239 bp的B多態(tài)位點共有2個等位基因，117 bp(B7)和119 bp(B8)。含有B8等位基因的山羊較含有B7等位基因的山羊有更高的感染副結(jié)核桿菌的比率。上述研究表明，SLC11A1基因多態(tài)與對病原微生物的抗性或易感性有密切關(guān)系，并且往往頻率較高的同質(zhì)基因型和抗性有較密切的關(guān)系[29]。而本研究中基因型 GT12/12 和GT13/13 剛好符合這一規(guī)律。并且通過與其他牛種相對應(yīng)基因頻率χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，中甸犏牛MS1的GT12/12和MS3的GT13/13基因型與抗病性有關(guān)聯(lián)[8,14-15,25]。

綜上，本研究揭示了中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)的多態(tài)性，并對其多態(tài)性與對病原微生物的抗性進行了評估，對中甸犏牛SLC11A1基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)性的了解有助于抗病育種策略的制定和抗性牛的選育。