李 杰，張星星，郭 晶，孟慶玲，喬 軍*，張國(guó)武，王曉婷，李 妍，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-3]，以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血為臨床特征，病死率高[4]。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為法定報(bào)告動(dòng)物疫病[5]。ASF最初主要在非洲流行，隨后在意大利撒丁島、西班牙、葡萄牙、加勒比地區(qū)、巴西以及東歐等國(guó)家或地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[6]。2017 年，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)發(fā)生ASF疫情，導(dǎo)致該病傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加。因此，我國(guó)急需提高對(duì)該病的檢疫和監(jiān)測(cè)能力。

目前，血清學(xué)檢測(cè)是診斷和監(jiān)測(cè)豬群ASFV感染的重要方法之一[7]。然而，現(xiàn)有的ASFV血清學(xué)檢測(cè)方法中，所使用的ASFV診斷抗原或?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)的全病毒抗原，或?yàn)锳SFV單一的重組蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒抗原雖然敏感性較高，但需要培養(yǎng)活病毒，存在生物安全方面的問(wèn)題[8]；單一重組蛋白抗原雖具有較高的特異性，但敏感性不高，檢出率較低。因此，制備特異性強(qiáng)和敏感性高的ASFV診斷用抗原是研發(fā)高效血清學(xué)診斷方法的關(guān)鍵。有研究表明，p30和p54蛋白均可誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，其中p30具有最佳的診斷抗原性能[7]。鑒于此，本研究將ASFVp30和p54基因進(jìn)行融合，構(gòu)建了p30-54融合基因，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，分析了融合蛋白的反應(yīng)原性，制備了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗體，以期為ASFV診斷用抗原的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株及試劑

pET-28a(+)、pMD18-T載體、E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。IPTG、X-gal、DNA Marker、核酸限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、T4 DNA Ligase和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。ASFV陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。商品化ASFV抗體檢測(cè)ELISA試劑盒(西班牙INGENASA公司生產(chǎn))購(gòu)自廣州測(cè)迪生物科技有限公司。

1.2 ASFV p30和p54基因的體外合成

根據(jù)GenBank中登錄的ASFVp30和p54基因序列，運(yùn)用在線軟件Racc(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)對(duì)上述基因序列中大腸桿菌稀有密碼子預(yù)測(cè)分析，將其稀有密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，由華大基因有限公司進(jìn)行體外合成。

1.3 ASFV pT-p30-54重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)進(jìn)行p30-54融合基因的構(gòu)建。根據(jù)p30和p54基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物。Fp30：5′-GGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn));Rp30：5′-GTTTAATGACCATGAGTCTTA-3′。Fp54：5′-GAGCACATAACTTTATTCAAACCA-3′；Rp54：5′-CCTCGAGTTACAAGGAGTTTTCCAGGTC-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。用Fp30-Rp30擴(kuò)增p30基因片段、Fp54-Rp54擴(kuò)增p54基因片段，分別回收PCR產(chǎn)物。SOE-PCR采用20 μL反應(yīng)體系：Fp30、Rp54引物各0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，Pfu DNA聚合酶0.2 μL，加水至20 μL。SOE-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。SOE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并回收后，克隆入pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-p30-54，進(jìn)行測(cè)序。

1.4 重組表達(dá)載體pET-p30-54的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)pT-p30-54和pET28a(+)質(zhì)粒雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收p30-54目的基因和載體片段，用T4 DNA 連接酶4 ℃過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素抗性的固體培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，再經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的方法篩選獲得陽(yáng)性克隆pET-p30-54。

1.5 ASFV p30-54融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組載體pET-p30-54轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，次日挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日取200 μL菌液接種于20 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，加入1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，收集菌液。

1.6 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)和 Western blot 分析

將收集的菌液12 000 r/min離心1 min，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。以ASFV陽(yáng)性血清為一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行Western blot 分析。

1.7 多克隆抗體制備、純化和特異性檢測(cè)

將 IPTG誘導(dǎo)后的菌液用超聲破碎，按照Ni親和層析柱的操作步驟進(jìn)行p30-54融合蛋白的純化。將12只健康的昆明系小鼠分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只；將純化后的p30-54融合蛋白溶液終質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合，制備免疫原；同時(shí)將0.01 mol/L、pH值為7.2的PBS緩沖液與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合作為對(duì)照；然后通過(guò)皮下多點(diǎn)注射分別注射試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為200 μL；在首免10 d后進(jìn)行第2次免疫，二免2周后采血，分離血清，利用商品化的ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pT-p30-54的構(gòu)建與鑒定

pT-p30-54經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到與預(yù)期大小相符的1 140 bp目的基因片段(圖1)。經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)可得到1 140 bp的目的基因片段和2 692 bp的載體片段(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有ASFV完整的p30-54基因序列(圖3)，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pT-p30-54。

M.DNA Marker ；1—2.重組質(zhì)粒pT-p30-54；3.陰性對(duì)照

M.DNA Marker；1.pT-p30-54雙酶切；2.pT-p30-54單酶切

第1行為p30-54融合基因核苷酸序列：1—582位核苷酸為p30基因序列,583—1 140位核苷酸為p54基因序列；第2行為p30-54融合基因編碼的氨基酸序列

2.2 重組表達(dá)載體pET-p30-54的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒利用特異性引物成功擴(kuò)增出大小為1 140 bp的p30-54融合基因片段(圖4)。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后得到1 140 bp的目的片段和5 369 bp的pET-28a(+)載體片段(圖5)。表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-p30-54。

2.3 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)及Western blot分析結(jié)果

SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，ASFV融合蛋白p30-54在47.1 ku處有明顯條帶，與理論完全相符(圖6)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的p30-54融合蛋白可與ASFV陽(yáng)性血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，提示融合蛋白p30-54具有反應(yīng)原性。

M.DNA Marker；1—3.pET-p30-54陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增結(jié)果；4.陰性對(duì)照

M.DNA Marker；1.pET-p30-54；2.pET-p30-54雙酶切；3.pET-p30-54 單酶切

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1—3.pET-28a(+)空載體轉(zhuǎn)化菌株的誘導(dǎo)；6—8.pET-p30-54轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；9.Western blot分析

2.4 ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測(cè)結(jié)果

利用ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)免疫小鼠的血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，ASFV p30-54融合蛋白免疫的小鼠血清均呈陽(yáng)性，而對(duì)照組小鼠血清均呈陰性，表明成功制備了小鼠抗ASFV p30-54融合蛋白抗體。

3 結(jié)論與討論

ASFV是目前已知的唯一DNA蟲(chóng)媒病毒，基因組為線性雙鏈DNA，長(zhǎng)度在170～190 kb[4-5]，編碼150～200個(gè)病毒蛋白，其中p30、p54、p72等結(jié)構(gòu)蛋白是該病毒與宿主細(xì)胞相互作用的主要蛋白[6,9-10]，不但在病毒黏附和侵入過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9]，而且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。Lacasta等[12]構(gòu)建了ASFV基因組表達(dá)文庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有ASFVp54、p30、p72和可溶性血凝蛋白(sHA)編碼基因的文庫(kù)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫，表明p30、p54、p72等結(jié)構(gòu)蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)原性。

目前，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是ASFV血清學(xué)檢測(cè)最常用的方法[13-15]，國(guó)外已經(jīng)研發(fā)出商品化的試劑盒。西班牙研制的ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒通過(guò)阻斷酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法，將ASFV抗原預(yù)包被于聚苯乙烯微孔板上，加入待檢樣品后，樣品中抗體將與其抗原結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)記抗體和底物顯色，從而檢測(cè)樣品中ASFV抗體水平。然而，進(jìn)口的ELISA檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，限制了其廣泛使用，而國(guó)內(nèi)ASFV檢測(cè)試劑盒尚處于研發(fā)中。董志珍等[16]以原核表達(dá)的ASFV p30重組蛋白包被反應(yīng)板，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的ASFV抗體能與酶標(biāo)板中包被的p30抗原反應(yīng)，同時(shí)加入針對(duì)p30的酶標(biāo)單克隆抗體后參與抗原表位的競(jìng)爭(zhēng)，建立了一種檢測(cè)ASFV抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。Sastre等[17]建立了基于ASFV p72單抗的免疫層析法(LFA)，用于ASFV抗原的檢測(cè)。結(jié)果表明，建立的LFA方法與商品化的ELISA之間存在很好的相關(guān)性，雖然其敏感性略低于PCR方法(PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為38%，LFA為27%)，但明顯高于ELISA檢測(cè)試劑盒。該方法適用于野外測(cè)試野生動(dòng)物，并可用于設(shè)備簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室。Kazakova等[8]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了p30蛋白，通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)評(píng)估了p30 重組蛋白對(duì)ASFV抗體的檢測(cè)能力，對(duì)試驗(yàn)性和自然感染ASFV的家豬和野豬血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其特異性和敏感性可達(dá)98.75%和100%，并且感染6～8周后血清樣品即可檢測(cè)出特異性的ASFV抗體。

近年來(lái)，中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)正面臨著ASF傳入的嚴(yán)峻威脅，尤其是新疆北部，新疆邊境線長(zhǎng)達(dá)5 600 km，雖然與俄羅斯接壤地區(qū)目前尚未發(fā)生ASF疫情，但隨著ASF疫情的不斷擴(kuò)散，新疆具有極大的傳入風(fēng)險(xiǎn)，可能成為該病傳入我國(guó)的一個(gè)重要窗口。為此，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》，嚴(yán)防該病從境外傳入我國(guó)。因此，研發(fā)ASFV特異、敏感的檢測(cè)試劑對(duì)于防范ASF傳入我國(guó)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究表達(dá)了ASFV p30-54融合蛋白，并成功制備了抗該融合蛋白的多克隆抗體，為研發(fā)ASFV診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。