呂蘭欣，楊紅寧，顏曉慶，胡書群，燕憲亮，許 鐵

骨在一定程度上有再生和修復的能力，但是很多情況下僅僅依靠骨自身的再生能力修復無法完成，如車禍等外部因素造成的骨不連、感染或骨腫瘤切除后的骨缺損，整形外科手術(shù)(頜面、顱面以及口腔)等[1-2]。組織工程的提出為骨缺損修復這一難題的解決提供了希望，水凝膠支架被廣泛研究用于骨和軟骨組織工程領(lǐng)域[3-6]。膠原水凝膠制備簡便安全，不需要使用任何交聯(lián)劑，在37 ℃環(huán)境下自動交聯(lián)，且可以通過改變膠原濃度調(diào)整其力學性質(zhì)，同時膠原也是骨骼的主要組成成分之一，因此是一種有潛在應用價值的骨組織工程支架[7-9]。干細胞作為組織工程的種子細胞之一也被應用于骨組織工程領(lǐng)域。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, hMSCs)具有易獲取、易向成骨分化的特點，常作為骨組織工程的種子細胞[10-12]。作者的前期研究表明臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)可促進MSCs成骨分化。作者制備了鼠尾膠原水凝膠與人骨髓間充質(zhì)干細胞/人臍靜脈內(nèi)皮細胞(hMSCs/HUVECs)復合物，并對水凝膠的細胞相容性進行了研究，對共培養(yǎng)系統(tǒng)成骨分化能力進行了檢測，為水凝膠封裝細胞復合物用于骨缺損修復提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料鼠尾膠原(4.89 mg·mL-1)購自Corning公司；hMSCs由英國基爾大學ISTM研究所提供；HUVECs細胞購自ALLCELLS公司；細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑耗材均購自Hyclone公司；成骨誘導液配置所需試劑以及ARS染料均購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自VICMED公司；BCIP/NBT試劑購自美國AMRESCO公司；Live&Dead試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2儀器光學顯微鏡和熒光顯微鏡均購自德國Leica公司；全波長酶標儀購自美國Bio-tek公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；超凈工作臺購自中國蘇州安泰公司。

1.3膠原水凝膠—細胞復合物制備將hMSCs和HUVECs從液氮中取出復蘇，在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%～90%融合，胰酶消化計數(shù)后按hMSCs∶HUVECs=10∶0、hMSCs∶HUVECs=5∶5及hMSCs∶HUVECs=9∶1的比例將兩種細胞混合備用。按表1所示配置1.96 mg·mL-1濃度的膠原溶液(前期實驗顯示此濃度下形成的膠原水凝膠硬度適中且適宜細胞生長)和細胞復合物，取200 μL混合溶液加入1 cm2的樣品框內(nèi)，每個樣品所含細胞總量均為4×104，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中1 h，凝膠形成后取出轉(zhuǎn)移至24孔板培養(yǎng)。細胞接種7 d后在顯微鏡下觀察水凝膠中細胞的形態(tài)。

表1 配置膠原溶液和細胞復合物所需試劑

1.4細胞相容性檢測水凝膠—細胞復合物培養(yǎng)7 d后，每組取出兩個樣品進行Live & Dead染色，觀察細胞的存活和死亡情況。首先用PBS洗滌樣品3次，每次5 min，盡量去除培養(yǎng)液中的血清；將20 μL染料B加入10 mL PBS充分混勻，再加入5 μL染料A混勻；將混合好的染液加入樣品中避光孵育1 h后用PBS洗滌3次；用熒光顯微鏡觀察染色情況，485 nm激發(fā)光觀察活細胞情況，530 nm激發(fā)光觀察死細胞情況。

1.5細胞增殖檢測將水凝膠—細胞復合物制備后的3、5、7 d，用CCK-8來檢測細胞的增殖情況。CCK-8溶液以1∶10稀釋于培養(yǎng)基中混勻，每個樣品加入500 μL稀釋液后于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育2 h，然后每孔取100 μL液體轉(zhuǎn)移到96孔板中，在酶標儀上讀取450 nm波長處吸光值。樣品換入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實驗重復3次，每樣品設(shè)置6個重復。

1.6成骨分化檢測為了檢測HUVECs，在第7天CCK-8檢測結(jié)束后，PBS洗滌樣品3次，加入成骨誘導液(包括DMEM低糖培養(yǎng)基、10% 胎牛血清、1% 雙抗、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10 nmol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1抗壞血酸、300 mg·L-1谷氨酰胺、10 nmol·L-11, 25-羥基維生素D3)繼續(xù)培養(yǎng)。誘導7 d后，對成骨分化早期標志物堿性磷酸酶(alkaline phoshatase, ALP)進行檢測。每組取4個樣品用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，加入BCIP/NBT染液，避光放置30 min后用超純水洗1次，用倒置顯微鏡明場進行觀察。然后用丙酮浸泡1 h后取100 μL液體轉(zhuǎn)移至96孔板，用酶標儀于570 nm處測量反應后溶液的吸光值。誘導21 d后，用茜素紅S(alizarin red S,ARS)對成骨分化晚期標志物鈣結(jié)節(jié)進行檢測。每組取4個樣品，PBS漂洗后用70%乙醇固定1 h，用40 mM茜素紅S-PBS溶液染色20 min。染色后，樣品用自來水沖洗5遍，用倒置顯微鏡明場觀察。然后，用10%十六烷基氯化吡啶溶液溶解被茜素紅S染色的鈣結(jié)節(jié)，于37 ℃反應30 min，取100 μL液體轉(zhuǎn)移至96孔板，用酶標儀于490 nm處測量反應后溶液的吸光值。

2 結(jié)果

2.1細胞相容性為檢測鼠尾膠原水凝膠以其制備過程對細胞的活性影響，對3組不同細胞比例的樣品進行了Live & Dead染色，如圖1所示，可見大部分細胞染色為綠色(圖1A-C)，為活細胞；極少量死亡細胞呈現(xiàn)球形，被染為紅色(圖1A’-C’)。這說明膠原本身以及水凝膠制備過程未對細胞活力產(chǎn)生影響。接種7 d后細胞形態(tài)如圖2A-C所示，可見細胞在水凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)長梭形，細胞之間形成網(wǎng)格狀連接。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0組；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5組；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1組；綠色：活細胞；紅色：死細胞。圖1 3組膠原水凝膠—細胞復合物培養(yǎng)第7天Live&Dead染色結(jié)果

2.2細胞增殖檢測為了檢測膠原水凝膠對細胞增殖能力的影響，對3組不同細胞比例的樣品進行了CCK-8檢測，結(jié)果如圖2D所示，3組細胞在第3天測得的OD值較低， hMSCs∶HUVECs=5∶5組最低(0.167±0.002)，hMSCs∶HUVECs=10∶0組最高(0.201±0.010)，hMSCs∶HUVECs=9∶1組居中(0.186±0.002)；第5天檢測結(jié)果顯示，各組OD值均略有增高；第7天檢測結(jié)果顯示，各組細胞的OD值均有顯著增加，hMSCs∶HUVECs=10∶0組與hMSCs∶HUVECs=9∶1組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)OD值分別為(0.964±0.025)和(0.951±0.040)，兩組細胞OD值與hMSCs∶HUVECs=5∶5組(0.805±0.029)相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0組；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5組；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1組；D：CCK-8結(jié)果。①與B組相比較，P<0.05。圖2 3組水凝膠—細胞復合物培養(yǎng)第7天明場顯微鏡觀察以及CCK-8檢測細胞增殖結(jié)果

2.3成骨分化檢測圖3所示為ALP染色結(jié)果，可見3組細胞均有明顯的成骨分化(圖3A-C)；圖3D為吸光值檢測結(jié)果，可見hMSCs∶HUVECs=5∶5組相較于其他兩組ALP產(chǎn)生量明顯偏少(P<0.05)；圖3E為根據(jù)hMSCs細胞量修正后的各組ALP檢測結(jié)果，修正后的結(jié)果顯示hMSCs∶HUVECs=5∶5組hMSCs產(chǎn)生ALP的量(0.319±0.008)顯著高于另外兩組，而hMSCs∶HUVECs=9∶1組(0.196±0.002)高于hMSCs∶HUVECs=10∶0組(0.170±0.004)。圖4為ARS染色結(jié)果，可見3組細胞均有明顯的紅色染色區(qū)域(圖4A-C)，說明3組細胞均有鈣結(jié)節(jié)的產(chǎn)生；圖3D為鈣結(jié)節(jié)染色溶解后吸光值檢測結(jié)果，同樣可見hMSCs∶HUVECs=5∶5組相較于其他兩組鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生量明顯偏少(P<0.05)；根據(jù)hMSCs細胞量進行修正后，各組鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生量的結(jié)果如圖4E所示，各組間的吸光值趨勢與ALP染色結(jié)果一致，hMSCs∶HUVECs=5∶5組hMSCs產(chǎn)生的量(1.482±0.012)顯著高于另外兩組，而hMSCs∶HUVECs=9∶1組(0.879±0.018)高于hMSCs∶HUVECs=10∶0組(0.786±0.018)。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0組；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5組；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1組；D：吸光值結(jié)果；E：根據(jù)細胞數(shù)修正后結(jié)果。①與B組相比較，P<0.05。圖3 3組水凝膠—細胞復合物誘導培養(yǎng)第7天ALP染色結(jié)果

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0組；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5組；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1組；D：吸光值結(jié)果；E：根據(jù)細胞數(shù)修正后結(jié)果。①與B組相比較，P<0.05。圖4 3組水凝膠—細胞復合物誘導培養(yǎng)第21天ARS染色結(jié)果

3 討論

自體骨移植一直被視為骨缺損治療的金標準，但其來源有限，異體骨和異種骨移植也存在排異反應等問題[13-15]。Ⅰ型膠原纖維含有精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列在內(nèi)的結(jié)合位點，有利于細胞的黏附和增殖，而且具有良好的生物降解性，易被生物體吸收，被廣泛應用于組織工程骨的組成成分之一[16-17]。骨組織工程支架既要為細胞的黏附和增殖提供空間，還要有一定的孔隙率和連通性以滿足骨和血管再生所需要的空間，還要為營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物提供運輸?shù)耐ǖ繹18-20]，而水凝膠支架則可以滿足以上要求。因此，本研究采用Ⅰ型膠原制備水凝膠—細胞復合物，接種7 d可見細胞伸展良好，細胞間形成連接，且在整個水凝膠支架內(nèi)部均勻分布(圖2A-C)，水凝膠內(nèi)整體細胞存活率高(圖1)，在渡過接種初期的適應期后細胞增殖速度明顯升高(圖2D)，這些結(jié)果也表明采用的水凝膠及制備方法均有很好的細胞相容性。Nguyen等也發(fā)現(xiàn)，在第3天進行Live & Dead染色，接種于培養(yǎng)板的細胞平鋪于表面，而封裝于膠原水凝膠內(nèi)部的細胞則明顯變窄伸長，更接近組織內(nèi)部細胞形態(tài)[9]。另外，有研究組用海藻酸鈉—殼聚糖水凝膠封裝MSCs，在第2天進行Live/Dead染色發(fā)現(xiàn)細胞有一些死亡，存活細胞呈現(xiàn)圓形，但CCK-8結(jié)果顯示細胞在第3天和第7天增殖明顯[21]。在膠原水凝膠中，細胞能夠更好地與膠原纖維上的RGD短肽結(jié)合，在接種早期即可黏附于膠原纖維上，所以會在第3天即呈現(xiàn)長梭形而非球形，這也說明了膠原水凝膠具有更好的生物相容性。本研究中在第7天時，50% HUVECs含量組測得的OD值明顯小于另外兩組，這可能是由于HUVECs的增殖能力與hMSCs有一定差距。Bidarra等的研究顯示，HUVECs與MSCs的共培養(yǎng)過程中，HUVECs所占百分含量會隨時間逐漸降低，這也意味著MSCs的增殖能力優(yōu)于HUVECs[22]。

ALP和鈣結(jié)節(jié)是MSCs成骨分化早期和晚期的標志物，在誘導分化的3～14 d，ALP含量會顯著增加，而鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分泌骨基質(zhì)并礦化形成的，是成骨晚期的主要標志物[10,23]。本研究選用BCIP/NBT染料在第7天對ALP進行染色，選用ARS在第21天對鈣結(jié)節(jié)進行染色，可見ALP和鈣結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。圖3D和圖4D的OD值檢測結(jié)果均顯示50%含量HUVECs的組ALP和鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生量明顯低于另外兩組，這一結(jié)果與其他研究者的結(jié)論不符。Gershovich和Saleh等均發(fā)現(xiàn)，HUVECs與hMSCs共培養(yǎng)時，ALP表達量顯著升高，這說明HUVECs可以促進hMSCs的成骨分化[24-25]。本研究根據(jù)hMSCs細胞量對吸光值結(jié)果進行了修正，修正后結(jié)果顯示10%含量的HUVECs對hMSCs成骨分化略有促進，而50%HUVECs對hMSCs成骨分化作用顯著，修正后結(jié)果與其他研究組結(jié)果相符。

本研究安全便捷地制備了一種復合hMSCs/HUVECs的膠原水凝膠，生物相容性好，可以促進干細胞的成骨分化，此膠原水凝膠—細胞復合物可注射且通過溫度交聯(lián)，是一種非常有前景的骨缺損修復材料。