阮圓張婷閆超王彥

1上海交通大學(xué) （上海 200240）2上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

硫酸羥氯喹（HCQ）是4-氨基喹酮類抗瘧藥，由2個(gè)芳香環(huán)構(gòu)成，氯喹中的一個(gè)乙基被一個(gè)羥乙基代替，也是一種獨(dú)特的抗風(fēng)濕病藥物。1944年人工合成，20世紀(jì)50年代隨著抗瘧藥在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)治療中的應(yīng)用[1]，硫酸羥氯喹用于風(fēng)濕性疾病治療的療效獲得肯定。因其獨(dú)特的作用機(jī)制和較好的安全性，硫酸羥氯喹在臨床風(fēng)濕病領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。20世紀(jì)90年代以后，臨床90%以上的風(fēng)濕病治療選用硫酸羥氯喹[2]。

隨著對(duì)其作用機(jī)制的深入研究，硫酸羥氯喹的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大：目前已廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、盤狀紅斑狼瘡（DLE）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]、青少年慢性關(guān)節(jié)炎，以及由陽光引發(fā)或加劇的皮膚病變；對(duì)皮肌炎、扁平苔蘚、原發(fā)性干燥綜合征（SS）、遲發(fā)性皮膚卟啉?。≒CT）等也有一定的療效。目前，美國藥典（USP）標(biāo)準(zhǔn)和中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)及部頒標(biāo)準(zhǔn)中，羥氯喹的測定均采用薄層色譜法。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用薄層色譜法來檢測硫酸羥氯喹的有關(guān)物質(zhì)時(shí)，存在專屬性不強(qiáng)、靈敏度低的問題，且薄層色譜法只能檢出有關(guān)物質(zhì)的限度，而不能測定出準(zhǔn)確的雜質(zhì)含量。英國藥典（BP）雖采用高效液相色譜法（HPLC）測定，但樣品制備步驟復(fù)雜。本文參考發(fā)明專利［4］，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)分析羥氯喹有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)進(jìn)行研究，樣品制備步驟簡便，色譜條件簡單，方法準(zhǔn)確且專屬性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200，1260型全自動(dòng)高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；AL 104電子天平、S 20精密pH計(jì)，梅特勒-托利多國際有限公司。

1.2 試藥

硫酸羥氯喹片（批號(hào)為T140904，藥用級(jí)），上海中西制藥有限公司；硫酸羥氯喹工作用對(duì)照品（批號(hào)為140707，w=99.1%），甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和測定法

以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Waters Symmetry C8柱，150 mm×5 μm）；以甲醇-磷酸二氫鉀溶液（將2.72 g磷酸二氫鉀溶解在900 mL水中，加入2 mL三乙胺，用1 mol/L氫氧化鉀或磷酸調(diào)節(jié)pH至8.0，再加水至1000 mL）作為流動(dòng)相（梯度）；檢測波長為254 nm。梯度洗脫表見表1。由表1可知，梯度洗脫時(shí)緩沖液中磷酸二氫鉀與甲醇的體積比選取53∶47。在該條件下進(jìn)行等度洗脫時(shí)，雜質(zhì)分離不佳，運(yùn)行時(shí)間過長。

表1 梯度洗脫表

測定法：取供試樣品細(xì)粉適量，用稀釋液（由甲醇與磷酸二氫鉀溶液按體積比1∶1配制，下同）制成每1 mL中約含硫酸羥氯喹1.0 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取1 mL供試品溶液，置于100 mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。精密量取上述兩種溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。

2.2 專屬性試驗(yàn)

2.2.1 樣品專屬性試驗(yàn)

通過使用強(qiáng)光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法對(duì)供試樣品進(jìn)行加速破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑，同時(shí)考察方法的專屬性。

取供試樣品細(xì)粉適量，精密稱定，用稀釋液制成每1 mL中含硫酸羥氯喹1.0 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為未破壞的供試品溶液。酸、堿破壞樣品在稀釋前加入對(duì)應(yīng)量的堿或酸調(diào)節(jié)pH至中性。同法完成酸、堿空白輔料干擾試驗(yàn)。在上述色譜條件下，精密量取各破壞條件下的溶液20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。

表2 有關(guān)物質(zhì)-專屬性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)的峰能與主峰有效分離，說明色譜條件專屬性較強(qiáng)。

2.2.2 空白輔料干擾

取空白輔料適量，采用上述樣品專屬性試驗(yàn)方法，對(duì)空白輔料用強(qiáng)光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法進(jìn)行加速破壞，經(jīng)破壞的空白輔料溶液均不干擾樣品中雜質(zhì)的檢測。

2.3 線性試驗(yàn)

精密稱取硫酸羥氯喹工作用對(duì)照品0.025 7 g置于25 mL量瓶中，用稀釋液制成每1 mL中含硫酸羥氯喹1.0 mg的線性貯備液，再分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 置于 100 mL 量瓶中，加入稀釋液稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于對(duì)照溶液質(zhì)量濃度的40%～160%的線性溶液。分別精密量取上述線性溶液各20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，在0.004 112～0.016 448 g/L范圍內(nèi)，硫酸羥氯喹質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 重復(fù)性

取同一批號(hào)T140904（0.1 g）的供試樣品，按有關(guān)物質(zhì)測定法配制成供試品和對(duì)照溶液，平行測定6次并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判。經(jīng)測定，雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.68%，0.62%，0.62%，0.63%，0.64%，0.61%，平均總雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.63%，表明方法重復(fù)性良好。

表3 硫酸羥氯喹線性回歸試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 中間精密度

中間精密度考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響，主要的變動(dòng)因素為測定人員、測定儀器設(shè)備、測定日期等，6次試驗(yàn)的平均總雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60%，與重復(fù)性試驗(yàn)的平均總雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.63%）相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于10%，表明方法中間精密度良好。

2.5 檢測限與定量限

精密量取稀釋液20 μL注入液相色譜儀中，記錄電信號(hào)約為0.0903 mAU；精密稱取硫酸羥氯喹工作用對(duì)照品適量，用稀釋液稀釋至質(zhì)量濃度為300 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀中，主成分峰與基線噪音的信噪比為9.8，10.2，10.2；用稀釋液稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀中，主成分峰與基線噪音的信噪比為 3.2，3.6，3.6。

從以上試驗(yàn)可得，在本色譜條件下，硫酸羥氯喹的檢測限為100 ng/mL，定量限為300 ng/mL。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)T140904（0.1 g）的供試樣品，按有關(guān)物質(zhì)測定法配制成供試品，分別于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18 h 進(jìn)樣，考察主峰峰面積的日內(nèi)穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 樣品溶液日內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

不同時(shí)間進(jìn)樣的主峰峰面積的RSD為0.93%，測定結(jié)果均無顯著變化，表明供試樣品在18 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取硫酸羥氯喹工作用對(duì)照品（批號(hào)：140707）適量，按處方量加入空白輔料，設(shè)計(jì)3個(gè)不同質(zhì)量濃度（分別為80%、100%、120%）,制成每1 mL含硫酸羥氯喹0.01 mg的混合溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度分別配制3個(gè)供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行回收率測定，結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示平均回收率為99.52%，RSD為1.03%，表明準(zhǔn)確度較好。

表5 硫酸羥氯喹有關(guān)物質(zhì)測定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

使用色譜柱Waters Symmetry C8（150 mm×5 μm）將色譜條件中的參數(shù)作適度變化（如對(duì)流速、柱溫等參數(shù)作微小調(diào)整），對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)見表6。

對(duì)柱溫在20～30℃，流速在0.8～1.2 mL/min之間變化進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果顯示柱溫和流速對(duì)主成分及雜質(zhì)的保留時(shí)間有影響，但是對(duì)相對(duì)保留時(shí)間沒有影響，表明本方法耐用性良好。

3 結(jié)果與討論

（1）取甲醇與磷酸二氫鉀溶液體積比為47∶53的緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，不僅可提高分離度，也可縮短試驗(yàn)時(shí)間。

（2）硫酸羥氯喹在0.004 112～0.016 448 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：y=365 33x-3.56,R=0.999 5，檢測限為100 ng/mL，定量限為300 ng/mL。

本RP-HPLC法色譜條件簡單，檢測快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于羥氯喹有關(guān)物質(zhì)的測定。

表6 T140904（0.1 g）耐用性試驗(yàn)結(jié)果