李珂，張?bào)?，張鐵栓

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000

特發(fā)性肺纖維化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種由多種原因引起的以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂為基礎(chǔ)的肺間質(zhì)疾病[1]，臨床癥狀表現(xiàn)為刺激性干咳并進(jìn)行性加重的呼吸困難，疾病晚期可導(dǎo)致低氧血癥和心、肺等多種臟器功能衰竭[2]，死亡率高。目前發(fā)病機(jī)制尚未清楚，且臨床上缺乏有效的治療手段，目前多以皮質(zhì)類固醇激素聯(lián)合免疫抑制劑為主，但是治療效果差，不能有效制止病情的進(jìn)展和改善患者預(yù)后，而且存在一定的不良反應(yīng)[3]。因此發(fā)現(xiàn)有效的治療或延緩疾病進(jìn)展的方法是臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。該研究于2016年8月—2017年1月，選取由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的40只清潔級(jí)雄性SD大鼠為研究對(duì)象，采用醫(yī)用臭氧腹腔注射博來霉素致纖維化大鼠并觀察大鼠肺泡炎及肺纖維化程度、血清和 BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平變化及大鼠肺功能的變化，分析其在治療肺纖維化中的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的40只清潔級(jí)雄性SD大鼠為研究對(duì)象，7～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g，試劑：博來霉素注射液（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）。儀器：醫(yī)用臭氧發(fā)生器（山東淄博悅?cè)A醫(yī)療器械有限公司），以及小動(dòng)物肺功能測(cè)定系統(tǒng) HX200型呼吸流量換能器 （北京新行興業(yè)科貿(mào)有限公司）。ELISA試劑盒購(gòu)于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

40只清潔級(jí)SD大鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、激素組及試驗(yàn)組，每組10只，實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)7 d，其中模型組、激素組、試驗(yàn)組中的大鼠按照5 mg/kg（體質(zhì)量）的劑量于氣管內(nèi)滴入博來霉素（BLM A5）（國(guó)藥準(zhǔn)字H20055883）制作肺纖維化模型，對(duì)照組以相同方法于氣管內(nèi)滴入同等體積的生理鹽水（國(guó)藥準(zhǔn)字H20056626），注入后及時(shí)將大鼠旋轉(zhuǎn)直立使藥液在肺內(nèi)分布均勻。

1.3 藥物干預(yù)

氣管內(nèi)滴入藥物24 h后，每日給予藥物干預(yù)1次，試驗(yàn)組給予腹腔內(nèi)注射醫(yī)用臭氧，醫(yī)用臭氧濃度為60 μg/mL，激素組給予 1.4 mg/kg地塞米松（國(guó)藥準(zhǔn)字H12020516）灌胃，對(duì)照組與模型組給予相同體積的生理鹽水（國(guó)藥準(zhǔn)字H20056626）灌胃，持續(xù)28 d后處死并收集標(biāo)本。

1.4 肺功能測(cè)定

全部大鼠在注入博來霉素第28天時(shí)腹腔注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠，固定在鼠板上，沿氣管前正中逐層分離皮膚，暴露氣管，在氣管軟骨環(huán)間水平剪切氣管，插入Y型管，連接HX200型呼吸流量換能器，采用AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠第0.2秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.2秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV0.2/FVC)及呼氣峰流速(PEF)。

1.5 標(biāo)本的留取

測(cè)定肺功能后全部大鼠右心室采血用于TNF-ɑ、TGF-β1的檢測(cè)，結(jié)扎右側(cè)肺門，分離出雙肺和氣管。右肺用生理鹽水漂洗干凈，置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，取材、切片、HE染色，大鼠放血完畢后左肺行肺泡灌洗，分離出氣管在下段做一T形切口，采用外徑約1.5 mm的氣管插管插入氣管，若在過程中遇到阻力，說明到達(dá)氣管隆突部位，此時(shí)向左旋轉(zhuǎn)插管并稍微用力即可進(jìn)入左主支氣管，如果重新遇到阻力說明已到達(dá)左主支氣管分叉處，插管結(jié)束。無菌注射器抽取約4℃的生理鹽水2.5 mL通過插管緩慢地注入到肺內(nèi)，并停留約30 s，并緩慢回抽再反復(fù)注入肺內(nèi)，約3次，最后將回抽液體抽取到15 mL塑料離心管中，此為第1次灌洗液，此后重復(fù)操作4次，將灌洗液收集到同一個(gè)塑料離心管中待測(cè)。

1.6 標(biāo)本的觀察與檢測(cè)

1.6.1 病理學(xué)觀察 肺組織切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，根據(jù)文獻(xiàn)[4]的報(bào)道對(duì)肺組織的肺泡炎及纖維化程度進(jìn)行分級(jí)，轉(zhuǎn)為計(jì)量資料。其中0級(jí)：無肺泡炎及肺纖維化；1級(jí)：輕度肺泡炎或肺纖維化，受累面積少于全肺組織的20%；3級(jí)：中度肺泡炎或肺纖維化，受累面積為全肺的20%～50%；4級(jí)：重度肺泡炎或肺纖維化，受累面積大于全肺的 50%，依次記為 0、1、2、3 分。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA法）測(cè)定大鼠血清、BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平 取少量灌洗液在顯微鏡下計(jì)數(shù)，其余BALF無菌過濾至無菌離心管中離心，4℃，1 000 r/min,取上清液 5 mL，利用 ELISA 法測(cè)定血清和 BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺功能的比較

與對(duì)照組相比，模型組、激素組與試驗(yàn)組肺功能下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中模型組、激素組肺功能下降較試驗(yàn)組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）

組別 F E V 0.3(m L) F E V 0.3/F V C(%) P E F(m L/L)對(duì)照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗(yàn)組（n=1 0）5.9 0±0.5 2 3.3 6±0.3 3 4.2 6±0.3 5 5.0 3±0.4 8 7 8.1 5±2.1 1 4 2.9 8±1.9 1 5 0.3 8±2.0 4 6 0.9 3±1.8 1 3 8.8 2±1.4 4 2 1.9 0±1.5 6 2 6.9 5±1.2 1 3 4.3 2±1.6 3

2.2 各組病理學(xué)評(píng)分的比較

在第28天時(shí)對(duì)大鼠肺組織切片肺泡炎及肺纖維化程度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、激素組與試驗(yàn)組病理評(píng)分均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，激素組與試驗(yàn)組病理評(píng)分明顯小于模型組，且試驗(yàn)組評(píng)分下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組肺泡炎和肺纖維化程度比較[（±s），分]

表2 各組肺泡炎和肺纖維化程度比較[（±s），分]

組別病理評(píng)分對(duì)照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗(yàn)組（n=1 0）0.0 0±0.0 0 2.8 0±0.4 2 2.1 0±0.7 4 1.4 0±0.5 2

2.3 各組血清、BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較

與對(duì)照組比較，模型組、激素組、試驗(yàn)組大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-ɑ、TGF-β1明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，激素組、試驗(yàn)組大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-ɑ、TGF-β1明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,其中試驗(yàn)組下降更明顯。見表3。

表3 各組血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較[（±s），pg/mL]

表3 各組血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較[（±s），pg/mL]

組別對(duì)照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗(yàn)組（n=1 0）血清T N F-ɑ T G F-β 1 B A L F T N F-ɑ T G F-β 1 1 0.0 7±0.6 4 2 8.5 8±1.4 8 1 8.1 4±1.6 7 1 2.0 3±1.4 4 6 2.9 1±1.1 6 9 6.1 1±1.5 6 8 5.0 6±1.9 7 7 5.4 1±1.9 3 1.5 0±0.0 3 2.8 9±0.1 3 1.9 5±0.7 2 1.7 5±0.5 3 1 1.9 7±0.9 4 2 3.1 3±1.4 5 1 7.9 8±0.7 9 1 5.1 0±0.7 4

3 討論

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種原因不明、慢性進(jìn)行性的肺間質(zhì)性疾病，病理基礎(chǔ)主要以彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺間質(zhì)纖維化為主[1]。一旦形成肺纖維化推薦的治療方法是肺移植，但是成本高、不良反應(yīng)多、條件有限。大多數(shù)肺纖維化患者病情進(jìn)展快，預(yù)后較差，生存期短，以前大多采用激素及免疫抑制劑治療，但療效欠佳，不良反應(yīng)大。因此發(fā)現(xiàn)有效的治療或者延緩病情進(jìn)展的方法迫在眉睫。

在肺纖維化的病程中，因?yàn)榉螕p傷產(chǎn)生的炎癥區(qū)域會(huì)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等的浸潤(rùn)，這些炎性反應(yīng)進(jìn)而產(chǎn)生IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子，炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增值和凋亡，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[5]。TNF-ɑ是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，主要是由單核-巨噬細(xì)胞分泌，在肺損傷時(shí)可以高度表達(dá)，一方面可以促進(jìn)白細(xì)胞趨化聚集，發(fā)揮促炎作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增值，另一方面激活中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等的功能，刺激產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，對(duì)其周圍細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[6-7]。TNF-ɑ可以誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞膠原mRNA的表達(dá)，并促進(jìn)血小板的聚集，進(jìn)一步釋放促纖維化細(xì)胞因子，比如 TGF-β1、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等[8]。 TGF-β1是分子量為 25 kD 的多肽，由 2條分子量為11 kD的亞單位通過二硫鍵連接而成，主要由肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌。TGF-β1在多種細(xì)胞因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中起著主導(dǎo)作用，它可以促進(jìn)TNF-ɑ、IL-6、PDGF等的高表達(dá)，從而導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞的增值和纖維增生[8]。TGF-β1可促進(jìn)纖維細(xì)胞激活向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可導(dǎo)致多種器官比如肝、腎纖維化和動(dòng)脈粥樣硬化[9]。因此測(cè)定血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的水平，再結(jié)合肺組織病理切片和肺功能結(jié)果，可以在一定程度上反應(yīng)肺纖維化程度。

臨床上醫(yī)用臭氧可以用于腰椎間盤突出癥、創(chuàng)傷及難治性潰瘍、病毒性肝炎、癌癥等的治療。有報(bào)道稱，肺纖維化與機(jī)體內(nèi)氧自由基的代謝紊亂有關(guān)，如果體內(nèi)缺乏清除氧自由基的過氧化物酶，則會(huì)加速肺纖維化的進(jìn)程[10]。醫(yī)用臭氧可以促進(jìn)體內(nèi)多種抗氧化酶的產(chǎn)生，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，清除氧自由基，降低氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷[11]。文獻(xiàn)[12]中同樣應(yīng)用醫(yī)用臭氧提高了大鼠肺組織中超氧化物歧化酶的含量，并降低了羥脯氨酸的含量，提示醫(yī)用臭氧能改善機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力。另外通過測(cè)定肺纖維化評(píng)分(1.2±0.4)分與肺功能證明醫(yī)用臭氧可以改善大鼠肺功能，降低肺纖維化程度，在纖維化評(píng)分與肺功能的對(duì)比上與該次研究結(jié)果相符。醫(yī)用臭氧同時(shí)被證明具有抗炎作用，它不僅能刺激拮抗炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子和免疫抑制因子釋放，而且刺激細(xì)胞內(nèi)皮釋放NO和PDGF等引起血管擴(kuò)張，促進(jìn)炎癥吸收，同時(shí)還具有一定的抗感染能力[12]。而肺纖維化患者往往多同時(shí)合并有細(xì)菌或者真菌感染。該研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組大鼠通過腹腔注射臭氧，TNF-α、TGFβ1水平下降明顯，結(jié)合肺功能及肺組織病理結(jié)果，進(jìn)一步證明了醫(yī)用臭氧能減輕肺纖維化中程度。相關(guān)機(jī)制可能是醫(yī)用臭氧具有的高度的氧化性刺激了體內(nèi)抗過氧化酶的過度表達(dá)，促進(jìn)氧自由基的清除，拮抗炎癥介質(zhì)的細(xì)胞因子產(chǎn)生增多。緩解了肺纖維化的進(jìn)一步加劇[13]。

綜上所述，醫(yī)用臭氧能有效抑制肺纖維化大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的釋放，緩解肺纖維化病程，可能這是醫(yī)用臭氧治療肺纖維化的機(jī)制之一，且具有經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于肺纖維化的治療具有一定前景。