劉 姣，周有祥，徐 琪，李 利，楊 潔，彭立軍,*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023）

紅曲菌（Monascus spp.）是我國傳統(tǒng)的藥食兩用絲狀真菌，自1884年Van Tieghem建立紅曲菌屬以來，已報道有12 種[1-2]。紅曲是紅曲菌發(fā)酵大米等淀粉類原料獲得的產(chǎn)品，在我國及東南亞有近兩千年的應(yīng)用歷史[3-5]。目前，我國商品化紅曲主要包括色曲、酯化紅曲以及功能性紅曲3 種，廣泛應(yīng)用于食品加工、釀造、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域[6-9]。

現(xiàn)代研究表明，紅曲菌可產(chǎn)生多種有益的次級代謝產(chǎn)物，主要包括紅曲色素（Monascus pigments，Mps）、莫納可林（Monacolin K，MK）、麥角固醇、γ-氨基丁酸（γ-anminobutyric acid，GABA）、不飽和脂肪酸等[10-12]。其中，Mps是我國允許使用的食品添加劑中唯一一個微生物來源的天然色素。不僅可用作食品著色劑，還具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化的功效，在我國應(yīng)用廣泛并遠銷海外[8-9,13]。與安全性頻頻受到質(zhì)疑的合成色素相比，天然安全的Mps產(chǎn)品需求日益旺盛[14-15]。

然而，1995年Blanc等[16]鑒定出紫色紅曲菌（Monascus purpureus）中的抑菌因子Monascidin A為橘霉素（citrinin，CIT）后，紅曲及其相關(guān)產(chǎn)品的安全性備受質(zhì)疑[17-19]。CIT為腎毒性真菌毒素，可引起腎腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀，對胚胎發(fā)育也有一定影響具有致畸性[20-22]。目前，歐盟和日本等地區(qū)和國家限定紅曲產(chǎn)品中CIT的含量應(yīng)低于0.02 mg/kg[23]。GB 1886.181—2016《食品添加劑 紅曲紅》和QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》規(guī)定紅曲紅產(chǎn)品中CIT的限量標準為0.04 mg/kg，功能性紅曲米中CIT的限量標準為0.05 mg/kg[24-25]。篩選低產(chǎn)或不產(chǎn)CIT菌株成為近二十多年紅曲研究的熱點[26-29]。

本研究通過超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法分析比較22 株紅曲菌發(fā)酵紅曲米中的Mps和CIT的含量差異，并利用主成分分析分析不同菌株及其產(chǎn)物差異的相關(guān)性。結(jié)果可為紅曲產(chǎn)品中CIT含量的控制，挑選高產(chǎn)Mps、低產(chǎn)或不產(chǎn)CIT的紅曲菌株提供數(shù)據(jù)參考，并為系統(tǒng)分析不同紅曲菌株代謝產(chǎn)物輪廓提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株信息見表1。21 株從中科院微生物研究所購得，M7為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室分離得到，其中14 株為模式菌株。

表1 實驗紅曲菌菌株信息Table 1 Information about Monascus strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂按1.5%～2%添加，用于PDA斜面的制備；米飯培養(yǎng)基：市售粳米浸泡2 h后晾干，稱取30 g裝于250 mL三角瓶中，用于紅曲菌的培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基均于（121±1）℃滅菌20 min。

甲苯、乙酸乙酯、甲酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國Merck公司；CIT標準品（C13H14O5，CAS號518-75-2，純度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

配制復(fù)合萃取劑：按甲苯-乙酸乙酯-甲酸體積比7∶3∶1配制，用于Mps和CIT的提取[30]。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC儀 美國Waters公司；AIRTECH SW-CJ-2FD潔凈工作臺 中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本松下電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CIT標準曲線的制備

以5、10、50、100、500 ng/mL梯度質(zhì)量濃度的CIT標準工作溶液進樣分析，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，制備標準曲線。

1.3.2 紅曲米制備

菌株活化與培養(yǎng)：將22 株紅曲菌株分別接種至PDA斜面，其中CGMCC 3.5845、CGMCC 3.5836和CGMCC 3.5843置于24 ℃，其他菌種均置于28 ℃培養(yǎng)15 d。孢子制備和接種：用無菌水洗滌孢子，經(jīng)兩層無菌擦鏡紙過濾后得孢子懸液，接種3 mL孢子液（105個/mL）至滅菌大米培養(yǎng)基中，混勻，培養(yǎng)條件同上，每菌株3 個平行，未接種米飯培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.3 樣品前處理

參照GB/T 5009.222—2008《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定》中固態(tài)紅曲類樣品的處理方法，略有改進，步驟：將紅曲米樣品于60 ℃左右烘干至質(zhì)量恒定后粉碎，稱取0.100 0 g左右樣品于2 mL離心管中，加入1 mL萃取劑，渦旋振蕩30 s后，超聲10 min，10 000 r/min離心2 min，收集上清液，殘渣重復(fù)萃取1 次，合并上清液后，氮氣吹干，以甲醇定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，待分析。

1.3.4 Mps及CIT含量及數(shù)據(jù)分析

Mps分析：固定相為BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），配備二極管陣列檢測器，分別于380、470 nm和520 nm波長下檢測紅曲黃色素、橙色素和紅色素，流動相條件參見文獻[31]。CIT分析：固定相為BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），配備檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長為500 nm，流動相條件參見文獻[23]。CIT標樣質(zhì)量濃度為500 ng/mL，進樣量為5 μL，以外標法定量。取質(zhì)量濃度為0～40 ng/mL系列梯度標準溶液，按照GB/T 27415—2013《分析方法檢出限和定量限的評估》測定儀器檢出限，方法檢出限按照0.1 g紅曲米定容至1 mL換算。

將22 株紅曲菌及對應(yīng)的Mps和CIT含量按類別歸一化后，導(dǎo)入SIMCA 13.0進行主成分分析，結(jié)果用得分圖和載荷圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲米形態(tài)分析

圖1 紅曲米形態(tài)比較分析Fig. 1 Comparison of morphology of Monascus fermented rice

由圖1可知，紅曲米外觀完整，稍有酸氣、味淡，其中13 個紅曲米呈紫紅色（1 株煙灰色紅曲菌、1 株火紅色紅曲菌、1 株橙色紅曲菌、7 株紫色紅曲菌、2 株紅色紅曲菌、1 株血色紅曲菌），9 個呈棕色（1 株發(fā)白紅曲菌、1 株紫色紅曲菌、1 株巴克紅曲菌、2 株從毛紅曲菌、1 株紅色紅曲菌、1 株佛羅里達紅曲菌、1 株蒼白紅曲菌、1 株新月紅曲菌），這可能與不同菌株所產(chǎn)的次級代謝產(chǎn)物的種類和含量不同有關(guān)。

2.2 CIT標準曲線的制備和檢出限

將CIT標準溶液配制為5～500 ng/mL系列梯度質(zhì)量濃度標準溶液，進樣量為5 μL，按1.3.4節(jié)中方法測定CIT含量，以CIT質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸分析，結(jié)果表明在0～500 ng/mL范圍內(nèi)，其CIT的線性回歸方程為y=4 165.7x-14 087，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，線性良好。按照GB/T 5009.222—2008，計算得到CIT的儀器檢出限為0.178 ng/mL，方法檢出限為1.78 μg/kg（按0.1 g紅曲米定容至1 mL計算），滿足國標分析要求[32]。

2.3 22 株紅曲菌Mps含量分析

將1.3.3節(jié)中處理的樣品于超UPLC-二極管陣列檢測器條件下分析，22 株紅曲菌中有13 株（M7、3.4629、3.2636、3.4443、3.5845、3.2093、3.5836、3.4634、3.4651、3.5838、3.4384、3.4453、3.4639）可產(chǎn)生2 種主要的黃色素Monascine（YP1）和Ankaflavin（YP2）、2 種主要的橙色素Rubropunctatin（OP1）和Monascuburin（OP2）、2種主要的紅色素Rubropunctamine（RP1）和Monascuburamine（RP2），色素結(jié)構(gòu)信息見參考文獻[33]，結(jié)果如圖2所示。

圖2 22 份紅曲米樣品中Mps含量分析Fig. 2 Mps contents of 22 red fermented rice samples

由圖2可知，M7、3.2636、3.4443、3.4651和3.5838可產(chǎn)生紅曲黃、橙、紅3種色素且含量均較高，其中黃、橙、紅色素含量最高的菌株分別為3.2636、3.4443和3.5838；3.2093、3.4384、3.4629、3.5836和3.5845中紅曲黃、橙色素含量較高且與前述M7等5 株菌所產(chǎn)黃、橙色素含量接近，而紅曲紅色素含量約為3.5838所產(chǎn)紅色素的1/10；3.4634可產(chǎn)生含量較高的紅曲黃、紅色素，而紅曲橙色素含量較低，含量僅為3.4443的1/100；3.4453和3.4639所產(chǎn)3 種色素含量均明顯低于其他11 個菌株的色素含量。此外，有9 株紅曲菌（3.4701、3.5844、3.7951、3.5843、3.4452、3.568、3.4646、3.4647和3.444）未檢出Mps。

2.4 22 株紅曲菌CIT含量分析

圖3 CIT標準品（a）及紅曲米中CIT（b）的液相色譜圖Fig. 3 Liquid chromatograms of citrinin standard (a) and citrinin in fermented rice (b)

質(zhì)量濃度為500 ng/mL CIT標準品溶液（圖3a）及紅曲米中CIT（圖3b）在1.3.4節(jié)所使用的色譜條件下出峰時間為8.927 min。由圖3可知，本研究中建立的UPLC方法分析紅曲米中CIT分離度較高，無雜質(zhì)干擾，可用于紅曲米中CIT的檢測。

圖4 22 份紅曲米樣品中CIT含量檢測Fig. 4 CIT contents in 22 fermented rice samples

22 份紅曲米中CIT含量最高的是橙色紅曲菌3.4384，含量為（1 263±40.48）mg/kg，已檢出的CIT含量最低的為蒼白紅曲菌3.5844，含量為（0.08±0.01）mg/kg。由圖4可知，17 份紅曲米樣品中CIT含量均超過我國功能性紅曲米中CIT限量標準（0.05 mg/kg），CIT含量在0.084～1 263.365 mg/kg之間，有5 份紅曲米（3.4701、3.4452、3.568、3.4646和3.444）中未檢出CIT。

2.5 22 株紅曲菌Mps和CIT的比較分析

通過UPLC分析22 份紅曲米中Mps和CIT的含量，結(jié)果表明22 株紅曲菌產(chǎn)物差異明顯。17 株紅曲菌中有4 株菌（3.4647、3.5843、3.7951和3.6844）僅產(chǎn)生CIT而不產(chǎn)Mps； 3.4443、3.4651、3.5838、3.2093、3.4629和M7發(fā)酵紅曲米中CIT含量較低，主要產(chǎn)物是紅曲橙色素和黃色素，其中橙色素的含量約為黃色素的2 倍；3.5845、3.2636、3.5836、3.4636及3.4384的主要產(chǎn)物均為CIT。隨后對這22 株紅曲菌樣本進行了主成分分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 22 株紅曲菌及其產(chǎn)物主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig. 5 PCA score plot (a) and loading plot (b) for pigment metabolites of 22 Monascus strains

圖5 顯示了不同菌株的代謝輪廓相似性信息和各產(chǎn)物的貢獻率。由圖5a可知，成分1累計貢獻率為62.9%，成分2累計貢獻率為18.9%，2 個成分的累計貢獻率達到81.8%，因此在95%置信區(qū)間內(nèi)，該2 個主成分的可信度較高。在得分圖中，22 株紅曲菌分為了4 組，其中左側(cè)11 個菌株（3.4639、3.4701、3.4453、3.444、3.4647、3.4646、3.5843、3.7951、3.5844、3.4452和3.568）聚集在一起，主要是由于這些菌株不產(chǎn)色素或CIT，或者產(chǎn)量較低；右側(cè)有10 個菌株分成了兩組，包括右上的5 個菌株（3.5836、3.4629、3.5845、3.2093和3.2636）和右下的5 個菌株（3.4634、3.4651、M7、3.4443和3.5838），其中右上的5 個菌株主要產(chǎn)黃、橙色素和CIT，右下的5 個菌株主要產(chǎn)紅色素和少量CIT；需要指出的是橙色紅曲菌3.4384因CIT含量過高而相對離散自成一組。該分析結(jié)果表明，在產(chǎn)Mps和CIT的紅曲菌株中，黃、橙色素與CIT呈正相關(guān)，而紅色素與CIT呈負相關(guān)。

3 結(jié) 論

紅曲菌可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，其中Mps作為一種天然、安全的微生物來源色素備受關(guān)注，安全、低產(chǎn)甚至不產(chǎn)CIT的Mps產(chǎn)品的開發(fā)是目前Mps產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要研究方向。

本實驗以22 株紅曲菌發(fā)酵紅曲米為研究材料，分析不同紅曲菌的產(chǎn)物特征。形態(tài)結(jié)果表明13 個紅曲米呈紫紅色，9 個呈棕色。進一步分析22 份紅曲米樣品的Mps和CIT含量，結(jié)果表明，有13 株紅曲菌可產(chǎn)生Mps和CIT，4 株紅曲菌僅產(chǎn)生CIT不產(chǎn)生Mps，5 株紅曲菌均不產(chǎn)Mps和CIT，這與紅曲米表觀形態(tài)結(jié)果相符。其中3.4443、3.4651、3.5838、3.2093、3.4629和M7發(fā)酵紅曲米中Mps含量較高且CIT含量較低，可用作高產(chǎn)Mps低產(chǎn)CIT的選育菌種。3.2093、3.4629的主要產(chǎn)物是橙色素，其含量約為黃、紅色素含量的2 倍和50 倍，且CIT含量僅為3.4384中CIT含量的1/1 000，可用作單一紅曲橙色素產(chǎn)品的開發(fā)。此外，有5 株菌（3.4701、3.4452、3.568、3.4646和3.444）既不產(chǎn)Mps也不產(chǎn)CIT，其代謝產(chǎn)物還有待進一步解析。利用主成分分析方法分析了紅曲菌的代謝產(chǎn)物差異和菌株之間的聯(lián)系，但還需更多的產(chǎn)物數(shù)據(jù)和方法探索，具體還有待進一步開展研究。本研究分析了實驗室條件下不同紅曲菌發(fā)酵紅曲米的產(chǎn)物差異，可為構(gòu)建不同紅曲菌代謝產(chǎn)物輪廓提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并可為實際生產(chǎn)中依據(jù)菌株產(chǎn)物差異進行針對性的工藝條件優(yōu)化提供參考。