宋 君, 李 潔, 常麗娟, 王 東,張富麗, 劉文娟, 雍 彬

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院 分析測試中心， 四川 成都 610066； 2.四川省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)村經(jīng)濟與農(nóng)業(yè)信息研究所， 四川 成都 610066；3. 四川師范大學 生命科學學院， 四川 成都 610101)

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系(商品名稱為YieldGardTMVTTMRootwormTMRR2)是孟山都公司(Monsanto Company)于20世紀90年代開發(fā)的“雙抗”(殺蟲兼抗除草劑)轉(zhuǎn)基因玉米.該品系人為構(gòu)建了2個表達框：增強啟動子eCaMV35S、終止子hsp調(diào)控的殺蟲基因Cry3Bb1表達框和啟動子ract、終止子NOS調(diào)控的抗除草劑基因CP4-epsps表達框.轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系經(jīng)過安全評價后,已有20多年的商業(yè)化種植歷史.1995年美國首次商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米MON88017,2006年日本和加拿大開始種植該轉(zhuǎn)基因玉米品系，2010年巴西和阿根廷也開始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米MON88017,洪都拉斯在2013年批準商業(yè)化種植該品系[1].轉(zhuǎn)基因玉米MON88017主要用于食品、飼料生產(chǎn)和加工的原材料或直接食用.我國于2010年批準進口該轉(zhuǎn)基因作物但僅用作加工的原材料，禁止商業(yè)化種植.雖然轉(zhuǎn)基因生物在許多國家已經(jīng)批準用作食品生產(chǎn)和加工的原材料，但由于種種原因消費者不完全接受轉(zhuǎn)基因食品.為了保護消費者的權(quán)益，許多國家出臺了轉(zhuǎn)基因食品的閾值標識管理政策，食品中轉(zhuǎn)基因成分的質(zhì)量分數(shù)超過規(guī)定的閾值必須進行標識[2].因此，對于國際貿(mào)易和標識管理，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的精準檢測及測量不確定度評定尤為重要.

由于轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測過程比較復雜、涉及多個中間量的測量以及目標片段的(最終)間接測量，對測量結(jié)果的影響因素較多(多次液體轉(zhuǎn)移、校準曲線兩次擬合、目標片段兩次絕對定量等).目前，評估影響測量因素及大小的方法有多種，但得到學術界和計量領域廣泛認可的方法主要有“不確定度傳播”(Law of Uncertainty Propagation,該法文件化為Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement,GUM)和“概率密度分布傳播”(Propagation of Probability Distribution,又名Monte Carlo Method,MCM)2種方法.雖然“GUM”和“MCM”都是基于統(tǒng)計學的測量不確定度評定方法，但是二者原理不同：前者是對各影響因子的均值及其不確定度(包括自由度等)通過數(shù)學模型進行傳遞，后者是對各影響因子的整個概率分布進行傳播[3-4].對于測量不確定度的評定，因GUM法存在“輸出量為正態(tài)分布等假設”的局限[5]，所以GUM法不適用于所有測量不確定度的評定.關于測量不確定度評定的研究與應用主要集中在物理、化學和機械制造等領域[6-10]，在生物領域的應用相對較少[11]，在轉(zhuǎn)基因生物定量檢測領域的研究與應用更是鮮有報道,僅見文獻[12-13]，但這些評定結(jié)果未經(jīng)MCM驗證，尚不知GUM法是否適用于轉(zhuǎn)基因生物定量檢測的不確定度評定.為了了解“GUM”和“MCM”方法在評定轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度中的差異及驗證“GUM”方法是否適用于轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度的評定，本文首次采用“GUM”和“MCM”方法對轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的測量不確定度進行評定，比較2種方法評定轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度的差異和確定GUM法在轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度評定中的適用性.

1 材料與方法

1.1材料、試劑和儀器用質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末作為標準物質(zhì)校準實時熒光PCR儀(擬合校準曲線).質(zhì)量分數(shù)為1.5%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017混合樣品(粉末)作為測試樣品(試樣)；DNA提取和實時PCR試劑采用北京TIANGEN生化技術有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒和Real Time PCR試劑盒(探針型)；超微量分光光度計(Thermo，USA)、實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem Incorporation,Foster city,USA)分別用于DNA質(zhì)量檢測和測量標準物質(zhì)、試樣的內(nèi)源基因zSSIIb和MON88017分子片段的絕對質(zhì)量(ng或copies);引物和探針采用本實驗室設計、報道的序列[14].

1.2DNA提取、校準曲線擬合及PCR體系配制稱取質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末和試樣各100 mg，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書操作.

將提取到的質(zhì)量分數(shù)為100%轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末的DNA溶液80 ng/μL，先稀釋到50 ng/μL，然后再以體積比1∶10稀釋成4個質(zhì)量濃度梯度(濃度點)：5、5×10-1、5×10-2、5×10-3ng/μL.根據(jù)Arumuganathan等[15]報道的玉米基因組大小，100 ng玉米DNA相當于3.65×104拷貝DNA.分別取3 μL上述4個質(zhì)量濃度點的DNA溶液作為擴增模板校準PCR儀(擬合標準曲線)，每個DNA溶液質(zhì)量濃度點做3次平行校準試驗.

25 μL PCR體系中包含 3 μL DNA梯度校準溶液(或50～100 ng試樣DNA),Taqman?Master mix(2×)12.5 μL，上/下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，補充滅菌水至25 μL.試樣PCR反應重復32次.PCR反應程序為95 ℃，10 min；95 ℃，15 sec；60 ℃，1 min(40 cycles).

2 數(shù)學測量模型

(1)式為轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的校準曲線

Ct=m×lgA+k，

(1)

式中，A為內(nèi)源、外源基因的絕對質(zhì)量(單位:ng或copies)，Ct是A的響應值(循環(huán)數(shù)閾值)，k和m分別為校準曲線的截距和斜率.

將試樣內(nèi)源、外源基因的Ct值代入(1)式，計算獲得試樣內(nèi)源、外源基因的絕對質(zhì)量.根據(jù)(2)式計算試樣中外源基因的質(zhì)量分數(shù)C(最終輸出量)

C=A外/A內(nèi)×100%，

(2)

式中,A外、A內(nèi)分別為試樣中外、內(nèi)源基因的絕對質(zhì)量.

3 不確定度評定

3.1MCM在轉(zhuǎn)基因玉米MON88017測量過程的校準曲線擬合階段，從校準子A和Ct(輸入量)的概率分布(probability distribution function,PDF)(根據(jù)已知信息、資料等設定輸入量的PDF)中分別隨機抽取M=106個樣本量，然后將獲得的2個106個樣本量(校準子A和Ct)分別通過數(shù)學模型(1)和Sega等[16]報道的方法獲得模型(1)的中間輸出量m和k.再從測試樣品Ct的PDF中抽取106個樣本量，通過數(shù)學模型(1)獲得測試樣品內(nèi)源、外源基因的絕對質(zhì)量A內(nèi)、A外(中間輸出量)，最后分別從A內(nèi)和A外的PDF中分別抽取106個樣本量，通過數(shù)學模型(2)獲得測試樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分數(shù)C(最終輸出量)的PDF、平均值、標準不確定度以及在95%包含概率下的包含區(qū)間.MCM評定中的所有計算由MATLAB程序完成.

3.2GUM法為了與MCM評定的不確定度成分一致，GUM法只考慮轉(zhuǎn)基因玉米MON88017測量過程中不確定度貢獻較大的成分：32次重復測量試樣貢獻的不確定度(A類)、用于PCR儀校準的系列DNA稀釋液產(chǎn)生的不確定度(B類)、校準曲線擬合的不確定度(B類)以及整個實驗中液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度.

根據(jù)一階泰勒級數(shù)近似和GUM法[3]，試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)(C)的測量不確定度

u(C)=

式中?C/?A88017、?C/?AzSSIIb分別是u(A88017)、u(AzSSIIb)的靈敏度系數(shù)，分別由(4)、(5)式確定.

?C/?A88017=1/AzSSIIb，

(4)

(5)

u(A88017)和u(AzSSIIb)分別是A88017和AzSSIIb的合成不確定度，通過(6)、(7)式計算獲得.

u(A88017)=

(6)

u(AzSSIIb)=

(7)

式中,u(rep88017)、u(repzSSIIb)是32次重復測量試樣中A88017、AzSSIIb的不確定度(A類),u(cali)是校準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度(B類),u(pip)是包括系列DNA稀釋液和PCR體系配制中液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度(B類).

A類不確定度采用Bessel公式計算:

(8)

根據(jù)GUM法[3]，作為非統(tǒng)計計算的B類不確定度u(cali)和u(pip)由(9)和(10)式計算:

u(cali)=

u(pip)=U(pip)/k，

(10)

式中,U(pip)是測量中使用的移液器的擴展不確定度，k為包含因子.各類量程移液器的不確定度通過“方和根”[17-18]合成得到整個實驗中移液器產(chǎn)生的總移液不確定度u(pip).(9)式中的s(Ct)為校準曲線擬合的標準誤差，由(11)式計算:

式中,n為校準測量次數(shù)，Cti是實時PCR儀對第i個校準子的響應值(熱循環(huán)數(shù)閾值)，Ai為第i個校準子.

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)C的擴展測量不確定度

U=kp×u(C)，

(12)

式中,kp是特定包含概率下的包含因子，u(C)為轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)C的合成不確定度.

4 結(jié)果

4.1MCM評定結(jié)果標準物質(zhì)校準實時定量PCR儀的結(jié)果見表1和表2.校準子的Ct響應值的標準方差SD都在0.02～0.64范圍內(nèi)，顯示每個校準子的三次校準的平行性較好.測試樣品中MON88017質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果(重復測量32次試樣的結(jié)果)見表3.轉(zhuǎn)基因玉米88017測量過程中輸入/出量(影響因子)遵守的概率分布和各輸入/出量的平均值、標準不確定度和95%包含區(qū)間見表4(Ct11～Ct53和Ct11#～Ct53#分別表示zSSIIb基因和88017測量中標準物質(zhì)各質(zhì)量濃度點的響應值；CtS1～CtS32和CtS1#～CtS32#分別表示試樣32次重復測量zSSIIb基因和88017片段獲得的Ct值；AzSSIIb和A88017分別表示試樣中zSSIIb和88017片段的絕對質(zhì)量；C表示試樣中88017片段的質(zhì)量分數(shù)；mzSSIIb和m88017分別為zSSIIb基因和88017片段的校準曲線的斜率；kzSSIIb和k88017分別為zSSIIb基因和88017片段的校準曲線的截距).根據(jù)最小二乘法原理、校準子與其響應值Ct的概率分布，擬合得到的zSSIIb基因和88017片段的校準曲線方程分別為y=-3.34x+31.81和y=-3.23x+33.06.將試樣Ct的概率分布輸入到zSSIIb基因和88017片段的校準曲線方程獲得輸出量AzSSIIb和A88017的平均值分別為396.80和5.99 ng，標準不確定度分別為6.62和0.14，95%包含概率的包含區(qū)間分別為383.98～409.92 ng和5.73～6.25 ng.把輸入量AzSSIIb和A88017的概率分布輸入測量模型(2)式，獲得最終輸出量88017片段質(zhì)量分數(shù)C的平均值、標準不確定度和95%包含概率的包含區(qū)間分別為1.51%、4.23×10-4和1.43%～1.59%.試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分數(shù)為1.51%，接近理論值(1.50%)，測量結(jié)果的相對偏差為0.7%，不確定度遠遠小于0.1%.在95%的概率下，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的相對含量測量值落在1.43%～1.59%范圍內(nèi).

在所有不確定度成分中，不確定度最大的成分是AzSSIIb(6.62)，其次是第5個校準子(0.005 ng/μL及其對應的Ct51、Ct52、Ct53和Ct51#、Ct52#、Ct53#)產(chǎn)生的不確定度(0.64和0.52).此外，除第2個校準子(5 ng/μL及其對應的Ct21、Ct22、Ct23和Ct21#、Ct22#、Ct23#)、kzSSIIb和k88017的不確定度較小外(小于0.1)，其余成分的不確定度在0.1～0.3.不確定度最小的成分是最終輸出量C(轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分數(shù)).

表 1 zSSIIb內(nèi)源基因校準曲線擬合

表 2 88017片段校準曲線擬合

4.2GUM評定結(jié)果將表1、表2的校準曲線擬合數(shù)據(jù)(B類評定)、表3的重復測量32次試樣的結(jié)果(A類評定)，代入(3)～(9)、(11)～(12)式計算得到內(nèi)源基因zSSIIb的重復性實驗的不確定度uzSSIIb(rep)、校準不確定度uzSSIIb(cali)以及MON88017片段的重復性實驗的不確定度u88017(rep)、校準不確定度u88017(cali)見表5.在本次轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)測量過程中，使用1 000 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移625 μL液體2次、320 μL液體2次；使用100 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移90 μL液體4次、50 μL液體4次、40 μL液體2次、30 μL液體1次、22 μL液體91次、18 μL液體1次；使用10 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移10 μL液體4次、3 μL液體91次.根據(jù)本實驗室1 000、100、10 μL量程的移液器校準證書，3種量程移液器的標準不確定度(擴展不確定度除以包含因子)分別為1.731、0.462和0.069 μL.根據(jù)(10)式和“方和根”方法[17-18]分別計算得到轉(zhuǎn)移液體625 μL產(chǎn)生的不確定度uV625(pip)、320 μL產(chǎn)生的不確定度uV320(pip)、90 μL產(chǎn)生的不確定度uV90(pip)、30 μL產(chǎn)生的不確定度uV30(pip)、50 μL產(chǎn)生的不確定度uV50(pip)、40 μL產(chǎn)生的不確定度uV40(pip)、22 μL產(chǎn)生的不確定度uV22(pip)、18 μL產(chǎn)生的不確定度uV18(pip)、10 μL產(chǎn)生的不確定度uV10(pip)、3 μL產(chǎn)生的不確定度uV3(pip)以及整個實驗中移液產(chǎn)生的總不確定度u(pip)(表5).采用GUM法獲得的zSSIIb基因和88017片段的校準曲線方程分別為y=-3.33x+31.63和y=-3.25x+32.63.試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分數(shù)為1.54%(表3)，與理論值(1.50%)的相

表 3 測試樣品中MON88017質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

表 4 各輸入/輸出量的分布及不確定度和95%置信度的包含區(qū)間

表 4(續(xù))

對偏差為3%，標準不確定度為0.1%(表5).在包含概率為95%時，kp=2，根據(jù)(12)式獲得轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的擴展不確定度為0.2%，即在概率為95%的條件下，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的測量值落在1.34%～1.74%范圍內(nèi).

在GUM法評定的不確定度成分中，不確定度貢獻最大的成分是u(AzSSIIb)和uzSSIIb(rep)(分別為6.621 0和6.606 4)，其次是u(pip)(0.321 4)，最小的不確定度成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的不確定度u(C)(表5).

MATLAB程序運行產(chǎn)生的混合樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的概率密度分布為正態(tài)分布,如圖1所示.

表 5 用GUM法評定MON88017玉米測量不確定度主要成分的概率分布、標準不確定度和靈敏度系數(shù)

4.3MCM與GUM法評定結(jié)果的比較從轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的測量結(jié)果來看，2種方法(MCM為1.51%，GUM法為1.54%)的測量結(jié)果都接近理論值(1.50%)，但是MCM獲得結(jié)果的相對偏差(0.7%)小于GUM法獲得的相對偏差(3%)；MCM計算得到轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的不確定度為4.23×10-4，遠遠小于GUM法評定得到的不確定度2×10-3(0.2%)；在95%的概率下，MCM計算得到轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的測量值分布在1.43%～1.59%范圍內(nèi)，比GUM法評定得到的范圍1.34%～1.74%窄.這些結(jié)果說明，MCM的評定結(jié)果優(yōu)于GUM法的評定結(jié)果.此外，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的概率分布在MCM與GUM法中都呈“鐘型”正態(tài)分布(圖1A和圖1B)，說明GUM法適用于轉(zhuǎn)基因生物測量不確定度的評定.

5 討論

測量不確定度是評估檢測結(jié)果可靠性的重要參數(shù)，尤其是當檢測結(jié)果位于限量值附近時，對產(chǎn)品的符合性判斷必須依靠檢測結(jié)果的不確定度才能做出正確判斷.本研究的評定結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法計算得到的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的概率分布都呈正態(tài)分布，充分說明了GUM法適用于轉(zhuǎn)基因生物測量不確定度的評定.本實驗中盡管GUM法適用于評定轉(zhuǎn)基因生物測量不確定度，但由于MCM從每一個變量的概率分布中隨機抽取“海量”樣本(106個)進行傳遞，所以MCM評定得到的95%概率下測量值分布范圍要小于GUM法得到的范圍，不確定度遠小于GUM法得到的結(jié)果.因此，比較發(fā)現(xiàn)MCM評定結(jié)果總體優(yōu)于GUM法的結(jié)果.

從本研究采用MCM與GUM法評定轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分數(shù)的不確定度過程可以看出，GUM法相對MCM存在一些局限，如應用GUM法需要考慮輸出量的概率分布是否為正態(tài)分布，需要應用偏導數(shù)計算各輸入量的靈敏度系數(shù)等(當測量模型復雜時，靈敏度系數(shù)的偏導數(shù)難求).MCM是對GUM法不確定度評定的一種補充方法，適用范圍較GUM法大.雖然MCM相對于GUM法有很多優(yōu)勢，但是由于MCM是建立在模擬產(chǎn)生“海量”實驗數(shù)據(jù)基礎上進行的測量不確定度評定，所以必須依靠計算機輔助才能完成.

測量不確定度的評定除了可以評估實驗數(shù)據(jù)的可靠性外，還可以根據(jù)不確定度成分對不確定度的貢獻大小，找出影響實驗結(jié)果的主要因素.本研究中，MCM與GUM法都發(fā)現(xiàn)AzSSIIb絕對質(zhì)量的不確定度最大，這可能與特定質(zhì)量的標準物質(zhì)或試樣中細胞的裂解率、DNA的提取率差異大有關.因此，轉(zhuǎn)基因生物的測量結(jié)果不采用基因的絕對質(zhì)量表示，而采用基因的質(zhì)量分數(shù)來表示.除此外2兩種方法都顯示液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度對測量結(jié)果的影響較大.事實上，在轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的定量檢測中，從配置系列不同質(zhì)量濃度的校準子、制備PCR混合液、分裝各種液體到添加DNA模板等，累計使用不同量程的移液器轉(zhuǎn)移各種不同液體上百次.轉(zhuǎn)基因生物定量檢測中使用的移液器都是微量移液器，維護和使用不當都會降低移液器的準確度，加上吸頭可能與移液器不匹配或吸頭對轉(zhuǎn)移液體的高吸附性等原因?qū)е乱埔涸谵D(zhuǎn)基因生物檢測過程中貢獻了較大的不確定度.因此，提高移液的準確度，降低移液的不確定度是提高轉(zhuǎn)基因生物定量檢測質(zhì)量的主要因素.