虞 青 吳 和 陳 嬋 徐恩盼 葉曉婷 王志翊△

(溫州醫(yī)科大學(xué), 1 附屬第二醫(yī)院急診科, 2 附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科, 3 第二臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系, 溫州 325027)

目前,肺纖維化、矽肺等終末期肺部疾病臨床上仍缺乏療效確切的藥物,惟一有效的治療手段是肺移植[1]。供體器官的極度短缺已成為制約器官移植發(fā)展的主要問(wèn)題,在肺移植中尤為突出。隨著組織工程的發(fā)展,肺組織工程如生物人工肺和器官重建為終末期肺部疾病患者的肺移植提供了一條新的器官來(lái)源路徑。生物人工肺和器官重建是基于種子細(xì)胞在天然或合成的三維支架材料中生長(zhǎng),其中支架材料的選擇是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。近年來(lái),研究人員利用去細(xì)胞技術(shù)已成功制備心、肺、腎等去細(xì)胞生物支架[2-6],所獲生物支架材料,因具有生物相容性好,無(wú)免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于組織工程研究領(lǐng)域[7]。但不同去污劑在去細(xì)胞過(guò)程中對(duì)器官組織結(jié)構(gòu)的損壞程度不一,本研究對(duì)比十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate, SD)2種常用去污劑在制備肺去細(xì)胞支架中的作用及效果,為制備理想的肺生物支架材料提供方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠20 只,體質(zhì)量(230±20) g,購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí)無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng),動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(浙)2010-0044。

1.2 主要試劑

十二烷基磺酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉(Sigma公司)；青霉素-鏈霉素抗生素混合液(上海博蘊(yùn)生物有限公司);DNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Omega公司);Masson三色染色試劑盒(Solarbio公司);兔抗膠原IV蛋白抗體、層黏連蛋白(laminin, LN)抗體、纖維連接蛋白抗體(fibronectin, FN)。

1.3 動(dòng)物分組和處理

30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成去細(xì)胞組SDS、脫氧膽酸鈉與正常對(duì)照組,每組10只。對(duì)照組SD大鼠按0.3ml/100g 10%水合氯醛行腹腔注射麻醉,全麻后打開(kāi)胸腔,分離出下腔靜脈,從下腔靜脈注射肝素1.5ml,行全身肝素化處理,分離切取新鮮全肺和心聯(lián)合體。去細(xì)胞組在正常對(duì)照組基礎(chǔ)上,采用去細(xì)胞技術(shù)制備全肺去細(xì)胞支架。

1.4 肺去細(xì)胞生物支架制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-9] ,20G留置針從心肺聯(lián)合體右心室插入肺動(dòng)脈,置管至肺主動(dòng)脈后結(jié)扎固定,肝素PBS灌注沖洗肺殘留血液至肺呈白色,1% Triton X-100 灌注1h。去細(xì)胞SDS組采用0.8%SDS灌注法,最后去離子水灌注6h,整個(gè)灌注過(guò)程恒溫37℃,灌注壓控制在8mmHg以?xún)?nèi),灌注液流速約8ml/min。去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組以0.8%脫氧膽酸鈉代替SDS,按照相同流程灌注。灌注過(guò)程中觀(guān)察各時(shí)間點(diǎn)肺顏色及形態(tài)的變化,將制備的肺去細(xì)胞生物支架用 PBS沖洗干凈, 4℃含抗生素PBS保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 去細(xì)胞全肺生物支架的觀(guān)察與鑒定方法

1.5.1 肺組織大體觀(guān)察 觀(guān)察各組肺組織的顏色及形態(tài)變化。

1.5.2 電鏡觀(guān)察 正常對(duì)照組及去細(xì)胞組肺組織經(jīng)2.5%戊二醛4℃固定24h,固定組織洗用生理鹽水清洗3次,每次15min,用梯度乙醇溶液脫水(70%、80%、90%、100%),脫水后的樣品移入臨界點(diǎn)CO2干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理。樣品在15kV掃描電子顯微鏡(S3000-N, Hitachi)。

1.5.3 DNA含量分析 分別切取正常對(duì)照組與去細(xì)胞組肺組織約100mg,經(jīng)勻漿、細(xì)胞裂解、去蛋白及純化后,提取基因組DNA (參照DNA試劑盒說(shuō)明操作),紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.5.4 H-E染色 正常對(duì)照組及去細(xì)胞組肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定,酒精梯度脫水、二甲苯透明石蠟包埋、切片,常規(guī)H-E染色后光鏡下觀(guān)察。

1.5.5 Masson染色 組織切片按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色,光鏡下觀(guān)察。

1.5.6 免疫熒光染色 對(duì)各組肺組織FN、 LN蛋白進(jìn)行免疫熒光染色,具體參考試劑說(shuō)明書(shū)操作,熒光顯微鏡下觀(guān)察各組肺組織FN、 LN蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大體觀(guān)察

正常對(duì)照組肺呈乳白色;兩組去細(xì)胞組肺在灌注過(guò)程中逐漸由外至內(nèi)變白,且逐漸變半透明,灌注完畢全肺變?yōu)槿榘咨胪该鳡?肉眼可清晰觀(guān)察到肺內(nèi)管道大體分支形態(tài),去細(xì)胞SDS組有較多明顯清晰的管道(圖1，見(jiàn)封三)。

2.2 掃描電鏡觀(guān)察

去細(xì)胞SDS組掃描電鏡下顯示結(jié)果未見(jiàn)明顯不同,且仍有明顯且完整的肺泡結(jié)構(gòu),去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組有肺泡結(jié)構(gòu)存在輕微破壞(圖2，見(jiàn)封三)。

2.3 基因組DNA含量分析

兩組去細(xì)胞組肺支架DNA含量顯著低于正常對(duì)照組肺組織(P<0.01);去細(xì)胞SDS組DNA去除率超過(guò)95%,去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組去除率約94%;兩實(shí)驗(yàn)組提取的DNA標(biāo)本A260/ A280比值均在1.8～2.0,標(biāo)本DNA純度較高(表1)。

2.4 H-E染色觀(guān)察

H-E染色顯示正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)格狀分布,細(xì)胞核清晰;去細(xì)胞SDS組肺支架僅可見(jiàn)網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),支架上未見(jiàn)殘存細(xì)胞及細(xì)胞核等結(jié)構(gòu),去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組肺支架可見(jiàn)網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)上附有殘存細(xì)胞核碎片(圖3，見(jiàn)封三)。

表1 各組肺組織DNA含量測(cè)定±s， n=10)

*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsSDS group

2.5 Masson染色

Masson染色顯示正常對(duì)照組肺組織較去細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組有更多呈網(wǎng)格狀分布的彈性纖維,去細(xì)胞SDS組有更多彈性蛋白殘留且構(gòu)架完整,去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組有輕度破壞(圖4，見(jiàn)封三)。

2.6 免疫熒光觀(guān)察

對(duì)照組層黏連蛋白、纖維蛋白主要表達(dá)于系膜、基膜及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中,兩組網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)有沒(méi)有破壞,去細(xì)胞SDS組完整,去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組輕微破壞(圖5，見(jiàn)封三);纖維連接蛋白呈完整紅色網(wǎng)格狀,去細(xì)胞SDS組著色度高,去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組著色度低(圖6，見(jiàn)封三)。

3 討論

去細(xì)胞生物支架制備技術(shù)主要是通過(guò)酶學(xué)法和化學(xué)法浸泡、灌注組織器官,去除組織器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞及可溶性蛋白成分,保留其不溶性ECM如彈性蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白、層黏連蛋白等。目前,常用的去細(xì)胞方法是通過(guò)胰蛋白酶、脫氧核糖核酸酶等酶消化水解,聯(lián)合Trition X-100、SDS、脫氧膽酸鈉等化學(xué)去垢劑灌注組織器官[10-11]。其中胰蛋白酶的主要作用是水解組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì),從而使細(xì)胞離散。但有研究報(bào)道,胰蛋白酶可水解彈性蛋白和膠原蛋白,對(duì)組織ECM結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重[11],而膠原和彈性蛋白是決定肺基質(zhì)力學(xué)性能的最主要成分。為了較好地保留肺組織ECM成分,本研究未使用胰蛋白酶。1%的Triton X-100一種比較溫和的去垢劑,常用于漂洗組織標(biāo)本,同時(shí)能有效去除較厚組織的細(xì)胞[12]。在去細(xì)胞生物工程研究中,離子型去污劑SDS和脫氧膽酸鈉的使用被認(rèn)為能減輕ECM超微結(jié)構(gòu)的破壞[13],且已作為常規(guī)去細(xì)胞試劑應(yīng)用于各種器官去細(xì)胞支架制備[14]。脫氧膽酸鈉常用于脊髓、胰等各類(lèi)器官去細(xì)胞支架的制備,去細(xì)胞效果較為良好[15]。但本研究結(jié)果顯示,在肺去細(xì)胞過(guò)程中,脫氧膽酸鈉對(duì)肺組織的結(jié)構(gòu)破壞較大,而SDS對(duì)肺組織的結(jié)構(gòu)破壞則不明顯,能較好地保留肺組織ECM成分。

本課題組制備的全肺去細(xì)胞支架經(jīng)Masson染色、免疫熒光染色等鑒定,結(jié)果表明2種試劑均能較完全地去除肺組織細(xì)胞及細(xì)胞核結(jié)構(gòu),同時(shí)保留ECM主要成分層黏連蛋白與纖維連接蛋白,但SDS灌注組制備的支架結(jié)構(gòu)完整性更高、延展性更好。去細(xì)胞支架中較為完整的肺泡結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的附著,提供近似天然的肺構(gòu)架,有利于組織構(gòu)建及恢復(fù)[16]。研究表明,去細(xì)胞支架殘留DNA濃度小于50ng/mg(干重)且H-E染色未見(jiàn)明顯細(xì)胞核結(jié)構(gòu),移植在生物體內(nèi)能避免免疫排斥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示去細(xì)胞SDS組支架DNA含量明顯小于去細(xì)胞脫氧膽酸鈉灌注組,且低于避免免疫排斥反應(yīng)的DNA含量標(biāo)準(zhǔn),可見(jiàn)采用SDS灌注制備的去細(xì)胞支架生物組織相容性更強(qiáng),有利于后續(xù)肺細(xì)胞植入、再生方面實(shí)驗(yàn)研究的開(kāi)展[18-19]。

本研究通過(guò)灌注法,對(duì)比SDS、脫氧膽酸鈉兩種化學(xué)去污劑制備的肺去細(xì)胞支架,結(jié)果表明SDS組灌注制備的肺生物支架在組織結(jié)構(gòu)完整性、DNA殘留量等方面均優(yōu)于脫氧膽酸鈉組,是一種較理想的制備組織工程肺生物支架材料的化學(xué)去污劑。

圖版說(shuō)明(圖見(jiàn)封三)

圖1 全肺大體觀(guān)察。A： 新鮮正常心肺組織,呈乳白色;B： SDS組支架,呈乳白色半透明,管道明顯;C： 脫氧膽酸鈉組支架,呈乳白色半透明,管道較少.

圖2 掃描電鏡結(jié)果。A： 正常對(duì)照組,肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整; B： 去細(xì)胞SDS組,肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整;C： 去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組,肺泡結(jié)構(gòu)輕微破壞.

圖3 肺組織病理學(xué)H-E染色,×200。A： 正常對(duì)照組,肺泡結(jié)構(gòu)完整,組織布滿(mǎn)藍(lán)色細(xì)胞核; B： 去細(xì)胞SDS組,肺去細(xì)胞支架呈網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),支架上無(wú)細(xì)胞及細(xì)胞核等結(jié)構(gòu); C： 去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組,肺去細(xì)胞支架呈網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),呈粉藍(lán)色,無(wú)細(xì)胞及細(xì)胞核等結(jié)構(gòu).

圖4 肺組織病理學(xué)Masson染色,×200。A： 正常對(duì)照組,肺泡結(jié)構(gòu)完整,藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上布滿(mǎn)紫紅色細(xì)胞核,彈性蛋白豐富; B： 去細(xì)胞SDS組,去細(xì)胞支架呈藍(lán)色網(wǎng)狀,無(wú)紫紅色細(xì)胞核殘留; C： 去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組,去細(xì)胞支架呈藍(lán)色網(wǎng)狀,有紫紅色細(xì)胞核殘留.

圖5 層黏連蛋白免疫染色,×200。A： 正常對(duì)照組,層黏連蛋白呈陽(yáng)性; B： 去細(xì)胞SDS組,層黏連蛋白呈陽(yáng)性;C： 去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組,層黏連蛋白呈陽(yáng)性,著色度低,含量少.

圖6 纖維蛋白免疫染色,×200。A： 正常對(duì)照組,纖維連接蛋白呈陽(yáng)性; B： 去細(xì)胞SDS組,纖維連接蛋白呈陽(yáng)性;C： 去細(xì)胞脫氧膽酸鈉組,纖維連接蛋白呈陽(yáng)性,著色度低,含量少.

Explanation offigures(See inside back cover)

Fig 1 Visual observation. A： Fresh normal lung tissues were milky white; B： SDS group scaffold, showing milky white translucent and obvious duct; C： Sodium deoxycholate group scaffold, showing milky white translucent and less duct.

Fig 2 SEM results. A： Control group, the alveolar structure were clear and complete; B： SDS group, the alveolar structure clear and complete； C： alveolar structure were destroyed slightly in the deoxycholate sodium group.

Fig 3 Lung tissue pathological graphics H-E staining, ×200. A： Control group: the alveolar structure integrity, tissue covered with blue nuclei; B： SDS group: lung acellular scaffold was grid shaped structure, and the bracket structure without cells and nuclei; C： Sodium deoxycholate group showed a grid-like structure, pink and blue without cells and nuclei.

Fig 4 Masson staining of lung tissue, ×200. A： Control group: the alveolar structure integrity, the blue reticular structure was covered with purple nucleus, and the elastic protein was rich; B： SDS group: acellular blue mesh, no red nucleus; C： Sodium deoxycholate group: the scaffolds were blue mesh with purple red nucleus residue.

Fig 5 Immunofluorescence of laminin, ×200. A： Control group, laminin positive; B： SDS group, laminin positive; C： Sodium deoxycholate group, laminin positive, coloring degree being lower and less.

Fig 6 Immunofluorescence of fibronectin, ×200. A： Control group,fibronectin positive； B： SDS group, fibronectin positive; C： Sodium deoxycholate group, fibronectin positive coloring degree being lower and less.