史金先，張賜童，劉 璐， 黃天意，閆通通，孫世群，王曉容

(1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春 130021;2．吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 長春 130021)

銀(Ag)具有抗菌譜廣和抗菌能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來以納米銀、銀鹽等不同形式添加到醫(yī)療產(chǎn)品中以增強(qiáng)其抗菌性能[1]。銀及其化合物作為抗菌劑時(shí)主要是銀離子(Ag+)發(fā)揮抗菌作用[2],然而Ag+與水接觸時(shí)釋放速度加快，影響材料的抗菌長效性，同時(shí)過量釋放的銀還會(huì)造成肝腎功能損害以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性的產(chǎn)生[3]，因此需要一種能夠使其緩慢釋放的方法保證抗菌的長效性及生物安全性[4]。納米載銀無機(jī)抗菌劑是將具有抗菌活性的Ag+通過物理吸附或離子交換等方式附載在無機(jī)載體上，有效控制Ag+釋放速度以達(dá)到長效抑菌的效果，還可降低銀的使用量，同時(shí)利用納米技術(shù)研制的納米載銀無機(jī)抗菌劑具有納米材料優(yōu)異的理化特性，可明顯增強(qiáng)抗菌性能[5]。

口腔是一個(gè)特殊的微生態(tài)環(huán)境，存在大量的條件致病菌和不斷變化的物理化學(xué)因素。材料在復(fù)雜的口腔環(huán)境中特別是唾液的長期浸泡下，溶解物通過口腔與機(jī)體內(nèi)各臟器相互作用。室溫固化型聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)是口腔科常用材料，本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)：添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的納米載銀無機(jī)抗菌劑可明顯增強(qiáng)室溫固化型PMMA材料的抗菌活性且不影響其機(jī)械性能[6]。但由于口腔環(huán)境特殊的理化性質(zhì)，材料長期在患者口內(nèi)發(fā)揮作用，不僅要求其具有良好的理化性能，生物相容性檢測(cè)也尤為重要。納米復(fù)合材料的毒性受多種因素影響，應(yīng)用于醫(yī)療產(chǎn)品中的納米材料及其所攜帶的金屬離子可從不同途徑進(jìn)入體內(nèi)，直接作用于遺傳物質(zhì)或通過促進(jìn)活性氧生成等機(jī)制造成潛在的毒性反應(yīng)[7]?，F(xiàn)階段有關(guān)納米復(fù)合材料的毒理學(xué)檢測(cè)結(jié)果不盡相同，主要是針對(duì)細(xì)菌和細(xì)胞系等進(jìn)行的體外研究，體內(nèi)研究報(bào)道仍然有限。本研究通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米載銀室溫固化型PMMA材料對(duì)小鼠肝組織及肝細(xì)胞DNA損傷的影響，旨在為納米載銀室溫固化型PMMA材料體內(nèi)毒理學(xué)研究提供理論依據(jù)，進(jìn)一步完善該材料的生物相容性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 40只雄性昆明種小鼠購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6～8周齡，體質(zhì)量(23±2)g，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(京)2014-0004。義齒基托聚合物Ⅱ型粉劑(仿生型)和液體(日進(jìn)齒科材料有限公司)，RHA-1型納米載銀無機(jī)抗菌劑(上海潤河納米材料科技有限公司)，正常熔點(diǎn)瓊脂糖(invitrogen)、低熔點(diǎn)瓊脂糖和甲基磺酸乙酯(EMS)(合肥博美生物科技有限公司)，Gel-Red染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測(cè)試劑盒和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。40 μm細(xì)胞過濾器(Biologix)和DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，IX71型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)，酶標(biāo)儀(美國 Biotek公司)。

1.2 抗菌試件及浸提液的制備 采用球磨法制備抗菌母料，再將抗菌母料充分研磨制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的納米載銀抗菌劑的室溫固化型PMMA材料。按照廠家說明書和國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T16886.12-2005)利用模具制作標(biāo)準(zhǔn)尺寸為25 mm×5 mm×2 mm的試件，采用水砂紙由粗到細(xì)逐次打磨拋光，分別將含和不含抗菌劑的PMMA試件按照1.0 g/5 mL比例浸泡于生理鹽水中，置于37℃恒溫?fù)u床中浸提72 h制備浸提原液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 40只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、納米載銀室溫固化型PMMA組(PMMA-NM組)和普通室溫固化型PMMA組(PMMA組)。其中浸提72 h浸提液(200 g·L-1)為高濃度組，將72 h浸提液稀釋1/2(100 g·L-1)為中濃度組，將72 h浸提液稀釋1/4(50 g·L-1)為低濃度組。同理將PMMA組也分為高濃度組、中濃度組和低濃度組，每組5只。各組小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境7 d。在實(shí)驗(yàn)開始、24 h和45 h采用相應(yīng)試劑對(duì)各實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組小鼠經(jīng)口灌胃，陽性對(duì)照組小鼠僅在24和45 h經(jīng)口灌胃給予EMS。陰性對(duì)照劑生理鹽水，陽性對(duì)照劑EMS和各實(shí)驗(yàn)組的浸提液的灌胃濃度為20 mL·kg-1，陽性對(duì)照組EMS的給藥濃度為100 mg·kg-1，EMS在每次使用前1 h內(nèi)溶解于生理鹽水中。最后一次灌胃后3 h取材。

1.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠在最后一次灌胃3 h后，摘眼球取血置于含分離膠的促凝管中，待血液自然凝固后，3 000 r·min-1離心15 min分離血清，按照試劑盒說明書操作，510 nm條件下酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣品的吸光度(A)值，絕對(duì)A值=測(cè)定孔A值-對(duì)照孔A值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的ALT/AST活力單位。剩余血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肝臟系數(shù)計(jì)算 在小鼠處死前稱量體質(zhì)量，處死后立即對(duì)其進(jìn)行解剖，去除肝臟周圍的結(jié)締組織，完整取出肝臟，稱肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.6 彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay，CA)檢測(cè)尾部DNA百分比(% tail DNA)、尾長(tail length,TL)和Olive尾矩(olive tail moment,OTM)水平 取新鮮肝臟左側(cè)外葉約5 mm3大小，在預(yù)冷的切碎緩沖液(20 mmol·L-1EDTA-2Na溶解于無鈣鎂和酚紅的Hank’s溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.5，使用前加10%DMSO)中短暫漂洗至無血液可見，將肝組織轉(zhuǎn)移至含有約3 mL切碎緩沖液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪刀精細(xì)剪碎以充分釋放肝細(xì)胞，經(jīng)40 μm細(xì)胞過濾器將細(xì)胞懸浮液過濾至50 mL離心管中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1。

將 100 μL 1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(溶于D-PBS)均勻鋪在預(yù)熱(37℃)的載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，置于4℃冰箱10 min使瓊脂糖凝固。取10 μL單細(xì)胞懸液與100 μL 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖(溶于D-PBS)混勻，將110 μL混合物均勻鋪在第一層瓊脂糖上，加蓋玻片，將載玻片置于4℃冰箱10 min，待其完全凝固后移除蓋玻片，將載玻片立即置于預(yù)冷的裂解溶液(100 mmoL·L-1EDTA-2Na，2.5 moL·L-1NaCl，10 mmoL·L-1Tris，調(diào)節(jié)pH值至10, 使用前加1%Triton-X100和10%DMSO)中4℃避光裂解1 h以上。細(xì)胞裂解后，用中和緩沖液(0.4 moL·L-1Tris-HCl，pH7.5)洗滌載玻片，將載玻片平行放置在加有預(yù)冷電泳液(pH值>13)的電泳槽內(nèi)，4℃避光使DNA雙鏈解旋30 min。然后以電場(chǎng)強(qiáng)度0.7 V·cm-1，電流300 mA電泳30 min，用Tris-HCl緩沖液中和3次，每次10 min。實(shí)驗(yàn)過程需在低溫避光條件下進(jìn)行，以防止額外的DNA損傷產(chǎn)生。最后用無水乙醇脫水固定15 min，室溫干燥后用Gel-Red染液進(jìn)行熒光染色。每張載玻片隨機(jī)選擇50個(gè)彗星圖像，每只動(dòng)物制備2張膠板，采用彗星圖像分析軟件CASP(Comet Assay Software Project)分析% tail DNA、TL和OTM，以上述3項(xiàng)指標(biāo)表示各組試劑對(duì)于小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布檢驗(yàn)采用One-sample Kolmogorov-Smirnov法，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，即M(Q)。不同材料組與陰性對(duì)照組間肝臟系數(shù)、%tail DNA、TL和OTM符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett’s test法；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料(ALT和AST)比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-wallisH)。納米載銀室溫固化型PMMA材料中不同濃度組間比較，符合方差齊性檢驗(yàn)的計(jì)量資料(TL和OTM)比較采用單因素方差分析；方差不齊的計(jì)量資料(% tail DNA)比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-wallisH)。陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組組間比較及相同濃度不同材料組2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清生化指標(biāo) 納米載銀室溫固化型PMMA組(低、中和高濃度浸提液)和室溫固化型PMMA組(低、中和高濃度浸提液)小鼠血清ALT和AST水平與陰性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同一濃度納米載銀室溫固化PMMA組 ALT和AST水平與室溫固化PMMA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠血清中ALT(A)和AST(B)水平

2.2 各組小鼠肝臟系數(shù) 實(shí)驗(yàn)過程中無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，小鼠各項(xiàng)生命活動(dòng)正常，未觀察到明顯的中毒癥狀和體征。各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟系數(shù)與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與陽性對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05)，陽性對(duì)照組小鼠肝臟系數(shù)明顯高于各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；納米載銀室溫固化PMMA組浸提液低、中和高各濃度間，同一濃度下的抗菌性室溫固化PMMA組肝臟臟器系數(shù)與普通室溫固化PMMA組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肝質(zhì)量、體質(zhì)量和肝臟系數(shù)

*P<0.05 compared with positive control group.

2.3 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞% tail DNA、TL和OTM 納米載銀室溫固化型PMMA組(低、中和高濃度浸提液)和室溫固化型PMMA組(低、中和高濃度浸提液)的% tail DNA、TL和OTM與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同一濃度下的納米載銀室溫固化型PMMA的% tail DNA、TL和OTM與普通室溫固化PMMA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對(duì)照組的% tail DNA、TL和OTM明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠肝細(xì)胞% tail DNA、TL和OTM

*P<0.05 compared with negative control group.

3 討 論

納米載銀無機(jī)抗菌劑具有耐高溫、抗菌譜廣且抗菌效能持久等優(yōu)點(diǎn)，近年來不斷被應(yīng)用于口腔新型材料的研發(fā)中[8]。然而各類納米材料的不斷研發(fā)應(yīng)用常伴有一些潛在的不良反應(yīng)[9]：一方面金屬納米材料會(huì)增強(qiáng)離子在器官中的聚集；另一方面，納米粒子一旦聚集在器官中一般需要很長時(shí)間才能清除，并且可能會(huì)產(chǎn)生持續(xù)的毒性[10]。納米載銀無機(jī)抗菌劑作為一種新型納米抗菌材料對(duì)人體可能存在潛在的危害性。

研究[11]表明：Ag+和納米銀聚集的主要靶器官是肝臟，其可通過產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起氧化應(yīng)激造成肝損傷，影響肝臟的正常生理功能。肝臟系數(shù)以及血清生化指標(biāo)能準(zhǔn)確反映化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝臟的影響，血清中ALT和AST是反應(yīng)肝功能損害最靈敏且使用最為廣泛的2種轉(zhuǎn)氨酶。正常情況下，ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，這2種酶由受損的肝細(xì)胞釋放到血液中，導(dǎo)致血清中酶水平升高[12]。Qin等[13]將納米銀以及AgNO3對(duì)大鼠口服染毒28 d，結(jié)果顯示：肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯變化，而血清生化指標(biāo)AST水平升高，提示血清生化水平是反應(yīng)其肝臟毒性的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中小鼠的肝臟系數(shù)和血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示：添加了納米載銀抗菌劑的室溫固化型PMMA材料的肝臟系數(shù)及ALT和AST水平未發(fā)生明顯變化，表明該復(fù)合材料未對(duì)肝組織及其功能造成損傷。

彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷和修復(fù)的遺傳毒性檢測(cè)方法[14],其具有需要組織細(xì)胞少，檢測(cè)快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。彗星實(shí)驗(yàn)作為檢測(cè)納米材料遺傳毒性最常用的實(shí)驗(yàn)方法[15]，現(xiàn)已通過經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)權(quán)威認(rèn)證并列入遺傳毒性檢測(cè)的序列實(shí)驗(yàn)中[16]。與傳統(tǒng)的遺傳毒性檢測(cè)方法體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)相比，具有受檢組織來源廣泛，對(duì)潛在的遺傳毒性評(píng)估能力更強(qiáng)、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)[17]。彗星實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)DNA修復(fù)以及各種類型的DNA損傷，包括DNA單、雙鏈斷裂，堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)(ALS)，DNA與DNA或DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)以及與單鏈斷裂相關(guān)的不完全修復(fù)位點(diǎn)等多種DNA損傷類型。任何可制備單細(xì)胞懸液的組織均可作為受檢對(duì)象，其對(duì)于靶器官潛在的遺傳毒性檢測(cè)也優(yōu)于其他經(jīng)典的遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)[18]。納米載銀無機(jī)抗菌劑的無機(jī)載體包括沸石、磷酸鹽和二氧化鈦等，其生物安全性與載體的種類、濃度和Ag+的釋放量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)使用的納米載銀無機(jī)抗菌劑的抗菌成分為載銀磷酸鋯，其具有抗菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣和耐高溫等優(yōu)點(diǎn)。Chen等[19]將納米載銀磷酸鋯、二氧化鈦、載銀二氧化鈦和四針狀氧化鋅晶須4種無機(jī)抗菌劑加入到含有晶須和納米氧化鋯的PMMA復(fù)合材料中，其中納米載銀磷酸鋯無機(jī)抗菌劑不僅增強(qiáng)了該復(fù)合材料的表面硬度，對(duì)變形鏈球菌和白色念珠菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，同時(shí)MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：其對(duì)于成纖維細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性?，F(xiàn)階段對(duì)納米載銀磷酸鋯的生物相容性研究局限于體外細(xì)胞毒性研究，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)的遺傳毒性研究較少。因此本課題組將進(jìn)一步利用體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)從遺傳毒性方面檢測(cè)納米載銀室溫固化PMMA的生物相容性。

Juling等[20]通過大鼠短期體內(nèi)研究證實(shí)納米銀及Ag+分布和聚集的主要臟器是肝臟，同時(shí)肝臟也是彗星實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)中最常用、遺傳毒理學(xué)資料最全面的體內(nèi)臟器[12]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠的肝臟作為制備單細(xì)胞懸液的組織臟器，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和相關(guān)遺傳毒理學(xué)資料的可比性。本研究中體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組% tail DNA、TL和OTM水平與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均明顯低于陽性對(duì)照組，提示該復(fù)合材料未對(duì)肝細(xì)胞造成DNA損傷，對(duì)小鼠肝細(xì)胞不具有遺傳毒性。同時(shí)相同濃度的納米載銀室溫固化PMMA組的DNA損傷水平與普通室溫固化PMMA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明抗菌性納米載銀室溫固化PMMA材料同普通室溫固化PMMA材料類似，均具有較好的生物相容性。

綜上所述，納米載銀室溫固化型PMMA材料未對(duì)小鼠肝組織及肝細(xì)胞DNA產(chǎn)生不良影響，具有良好的生物相容性。本研究結(jié)果為該納米復(fù)合材料的臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。