趙麗艷，宋 揚(yáng)，陳 勇，呂曉艷，賈茗博，李蘊(yùn)潛

(1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2．吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

惡性膠質(zhì)瘤是高度惡性和高致死性的常見(jiàn)顱內(nèi)腫瘤，最主要的生物學(xué)特性是侵襲性生長(zhǎng)，是手術(shù)難以徹底切除、術(shù)后復(fù)發(fā)率高和預(yù)后不良的重要原因，這種侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制尚未闡明。本課題組前期研究[1]表明：在一定條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞能發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)，EMT可能在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中起重要作用[2-3]。細(xì)胞EMT是一種由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞間的緊密連接缺失，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈哌w移、高侵襲的間質(zhì)細(xì)胞特征，是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和治療抵抗的重要原因[4]。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT，已成為抗腫瘤治療的新靶標(biāo)[5]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種具有多種生物活性的多酚化合物，研究[6]顯示：Res具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，但Res對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT影響的研究報(bào)道很少。本研究探討Res對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的抑制作用，為改進(jìn)膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基和胰酶-EDTA消化液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，Res購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司，Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品，抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、抗β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、抗波形蛋白(Vimentin)、抗Snail、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(1∶1 000)，抗Twist1抗體(中國(guó)萬(wàn)類生物公司)，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS蛋白上樣緩沖液(中國(guó)碧云天公司)，蛋白Marker(美國(guó)Thermo公司)，抗GAPDH抗體(美國(guó)Origene公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，每3～5 d用胰酶消化后按1∶2～1∶3傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blotting法檢測(cè)EMT標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平 本研究組MTT法的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Res終濃度在40 μmol·L-1及以下時(shí)對(duì)U87細(xì)胞的存活率影響不明顯，因此選擇40 μmol·L-1及以下濃度的Res進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度為每個(gè)培養(yǎng)皿5×105個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，再加入終濃度為10×10-6g·L-1轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)(EMT組)，加入20 和40 μmol·L-1Res(Res處理組)，作用48 h后棄掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，離心后棄去上清，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每孔加入30～50 μg蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，而后分別加入含有抗N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白，誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist1、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗，4℃過(guò)夜孵育后洗膜，加入相應(yīng)二抗孵育1～2 h后洗膜，加ECL顯色劑，在Sagecreation凝膠成像系統(tǒng)中顯影。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的條帶相對(duì)灰度值=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。以目的條帶相對(duì)灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.4 劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞接種于6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，再用含10×10-6g·L-1的TGF-β1無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h后，用10 μL的槍頭尖在6孔板上平行劃痕，用PBS沖掉刮下的細(xì)胞，并在顯微鏡下測(cè)量劃痕的寬度(0 h)，換用含40 μmol·L-1Res的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，測(cè)量劃痕寬度(24 h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞的遷移能力以細(xì)胞遷移率表示：細(xì)胞遷移率=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲率 Transwell小室(聚碳酸酯膜微孔徑8 μm)內(nèi)加入稀釋的Matrigel 100 μL。將Transwell小室插入24孔板，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h，使Matrigel在微孔濾膜上重組成基底膜結(jié)構(gòu)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，用TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞EMT(EMT組)及加入40 μmol·L-1Res(Res處理組)處理48 h后，消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液)。取2.5×105mL-1細(xì)胞懸浮在200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，加入Transwell小室的上室面，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，小室的下室內(nèi)加入500 μL含10%FBS培養(yǎng)基作為趨化劑。置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，吸棄培養(yǎng)基，用棉簽擦去上室面未穿過(guò)膜的細(xì)胞，PBS清洗。4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，0.1%結(jié)晶紫染色，將Transwell小室的濾膜取下，在顯微鏡下每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)染色的細(xì)胞數(shù)量，即穿膜細(xì)胞數(shù)，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。藥物對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響以細(xì)胞侵襲率表示：細(xì)胞侵襲率=(處理組穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組U87細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，EMT組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與EMT組比較，Res處理組間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。40 μmol·L-1Res處理組上述指標(biāo)變化較20 μmol·L-1Res處理組更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1和2。

2.2 各組U87細(xì)胞的遷移率 EMT組的細(xì)胞遷移率(68%±4%)明顯高于對(duì)照組(50%±5%,P<0.01)，而40 μmol·L-1Res處理組的細(xì)胞遷移率(37%±6%)較EMT組明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖2和3。

Lane 1:Control group;Lane 2:EMT group;Lane 3:20 μmol·L-1Res treatment group;Lane 4:40 μmol·L-1Res treatment group.

圖1 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)電泳圖

Fig.1 Eleectrophoregram of expressions of mesenchymal markers and transcription factors in glioma U87 cells in various groups

表1 各組U87細(xì)胞中N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白表達(dá)水平

Tab.1 Expression levels of N-cadherin, β-catenin and Vimentin in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsEMT group;#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

表2 各組U87細(xì)胞中Snail、Slug和Twist1蛋白表達(dá)水平

Tab.2 Expression levels of Snail, Slug and Twist1 in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsEMT group;#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

A-C: 0 h; D-F: 24 h; A, D: Control group; B,E: EMT group; C,F: Res treatment group.

*P< 0.01 vs control group; △P< 0.01 vs EMT group.

Fig.3 Migration rates of glioma U87 cells in various groups

2.3 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲率 EMT組的細(xì)胞侵襲率(71%±5%)明顯高于對(duì)照組(45%±6%,P<0.01)，而40 μmol·L-1Res處理組細(xì)胞侵襲率(35%±5%)明顯低于EMT組(P<0.01)。見(jiàn)圖4(插頁(yè)二)和5。

*P< 0.01 vs Control group; △P< 0.01 vs EMT group.

Fig.5 Invasion rates of glioma U87 cells in various groups

2.4 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，EMT組U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與EMT組比較，Res處理組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與20 μmol·L-1Res處理組比較，40 μmol·L-1Res處理組U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6和表3。

Lane 1:Control group;Lane 2:EMT group;Lane 3:20 μmol·L-1Res treatment group;Lane 4:40 μmol·L-1Res treatment group.

圖6 Western blotting法檢測(cè)各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.6 Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins in glioma U87 cells in various groups detected with Western blotting method

表3 各組U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

Tab.3 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsEMT group；#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤的一個(gè)顯著特點(diǎn)是高度侵襲性生長(zhǎng)，研發(fā)抑制侵襲性生長(zhǎng)的藥物對(duì)提高膠質(zhì)瘤的療效具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)[7-8]表明：EMT在膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)發(fā)生機(jī)制中起重要作用。上皮性腫瘤發(fā)生EMT時(shí)，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，其中E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)是EMT最重要的改變[9]，即EMT過(guò)程中出現(xiàn)E-鈣黏蛋白向N-鈣黏蛋白的“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換(cadherin switch)”，已成為EMT最關(guān)鍵的標(biāo)志[10]。然而，由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺少典型上皮細(xì)胞的特征，在大多數(shù)膠質(zhì)瘤E-鈣黏蛋白不表達(dá)或表達(dá)水平很低[11]，不出現(xiàn)經(jīng)典的“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”[12]，因此有時(shí)把膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣改變或過(guò)程。本研究未檢測(cè)E-鈣黏蛋白的表達(dá)。

本研究表明：在TGF-β1誘導(dǎo)下膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白表達(dá)水平均明顯升高，顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT改變，進(jìn)一步證明了本課題前期的研究結(jié)果[1]。近年來(lái)EMT抑制劑已成為抗癌藥物研究的重要方向[13]。Res是一種強(qiáng)效抗癌多酚類化合物。最近研究[14]顯示：Res一個(gè)新的抗癌作用是抑制腫瘤細(xì)胞EMT。在前列腺癌、肺癌和胰腺癌的研究[14-16]中已證明：Res能抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT，有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示：Res能明顯抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，表明Res能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT改變。

誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子(EMT-inducing transcription factors)主要包括Snail、Slug、Twist1和Zeb等，其通過(guò)不同信號(hào)通路下調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá)和抑制間質(zhì)標(biāo)志物(N-鈣黏蛋白和波形蛋白)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)和激活EMT，參與腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在TGF-β1作用下，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白的表達(dá)水平均升高，而Res處理能明顯抑制上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，表明Res能抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步證明Res能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT。

經(jīng)歷EMT的細(xì)胞最重要的行為改變是遷移和侵襲能力的增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示：發(fā)生EMT的U87細(xì)胞遷移率明顯增強(qiáng)，而Res處理可使細(xì)胞的遷移率明顯降低，表明Res可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT引起的細(xì)胞遷移能力。本研究Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：EMT組的U87細(xì)胞穿過(guò)人工基膜的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，細(xì)胞侵襲率增加，說(shuō)明誘導(dǎo)EMT使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，而Res處理組穿膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞侵襲率明顯降低，表明Res可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲能力。

基膜是腫瘤的天然組織學(xué)屏障，基膜降解是腫瘤侵襲的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMP-2和MMP-9又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶，通過(guò)降解基膜主要成分Ⅳ型膠原影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。最近報(bào)道[19-23]顯示：Res能明顯抑制人膀胱癌細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)。本研究結(jié)果顯示：EMT組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，而Res處理組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低。上述研究結(jié)果表明：Res能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT引起的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證明Res能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，Res能抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EMT，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力，抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，提示Res是抑制膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的重要候選藥物。Res抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT具有重要臨床意義，因?yàn)镋MT不僅在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，而且還能促使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性[21-23]。Res可以作為雙抑制劑，既抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，又抑制經(jīng)EMT產(chǎn)生的干細(xì)胞樣細(xì)胞，對(duì)包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤的治療具有重要價(jià)值。