尹芳蕊，龐春艷，耿立霞，王永福

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所 內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭014010)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatid arthritis,RA)是慢性炎癥性自身免疫性疾病，影響約世界1%人口，是造成傷殘的最普遍原因之一，但迄今為止 RA 病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，被認(rèn)為是遺傳、免疫和環(huán)境相互作用的結(jié)果[1-2]。免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NK細(xì)胞失調(diào)發(fā)生在RA的不同階段，在其發(fā)展過程中具有重要意義，早期RA 可無典型癥狀或僅呈現(xiàn)出單一臨床癥狀，且缺乏特異性診斷方法，探尋靈敏度高、特異度好的早期診斷標(biāo)志物和特異的治療靶點(diǎn)是 RA 診斷治療的最終目標(biāo)[3]。微小RNA(microRNA, miRNA )是非編碼小分子 RNA， miRNA與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，多種 miRNA 在RA中異常表達(dá)[4-6]，與 RA 的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，檢測 與RA 有關(guān)的 miRNA 譜，可為 RA 的早期診斷提供新的依據(jù)，為 RA 的治療提供新的選擇[7]。人類miR-124的3個(gè)編碼基因位于8q12.3、8p23.1和20q13.33，miR-124的表達(dá)異?？烧T發(fā)多種疾病產(chǎn)生及發(fā)展。miR-124 高度保守，在腦和脊髓神經(jīng)元中大量表達(dá)，目前研究多集中在其與神經(jīng)和腦疾病的相關(guān)性方面。miR-124a可促進(jìn)神經(jīng)元的分化[8]，是一種腦神經(jīng)保護(hù)和腦功能恢復(fù)的新的生物標(biāo)志物[9]。研究[10-11]表明：miR-124可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

miR-124與風(fēng)濕病的相關(guān)研究國內(nèi)外少見報(bào)道。Nakamachi等[12]研究發(fā)現(xiàn)：miR-124可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥狀，減少滑膜細(xì)胞增殖、白細(xì)胞浸潤、軟骨或骨破壞，用pre-miR-124處理后佐劑性關(guān)節(jié)炎鼠模型的破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)、整合素β1(integrin β1，ITGB1)和核因子活化的T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(activated T cells cytoplasmic 1，ATc1)表達(dá)水平均降低。

以上研究在動(dòng)物水平驗(yàn)證了miR-124可改善佐劑性關(guān)節(jié)炎鼠模型臨床癥狀，抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，但miR-124與RA細(xì)胞水平的研究尚未見報(bào)道。本研究從細(xì)胞水平設(shè)計(jì)通過miRNA-124a的過表達(dá)腺病毒載體，感染RA細(xì)胞模型小鼠巨噬細(xì)胞J774.1，探討miRNA-124a對小鼠巨噬細(xì)胞J774.1的可能作用機(jī)制，以期為RA的治療提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 J774.1細(xì)胞株購自上海軒研生物科技有限公司，過表達(dá)miR-124a的腺病毒液和miR-124a腺病毒陰性對照液購自武漢淅瑪公司，白細(xì)胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α) ELISA試劑盒購自上海生物工程有限責(zé)任公司，胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol和熒光定量試劑盒購自日本 TaKaRa 公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標(biāo)分析儀購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，熒光定量 PCR 儀購自中國 BIOER公司，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及miRNA轉(zhuǎn)染 J774.1巨噬細(xì)胞用含100 mL·L-1FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的J774.1細(xì)胞，胰酶消化培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每毫升1×106個(gè)細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組，即miR-124a過表達(dá)組(感染miR-124a腺病毒載體)、空載腺病毒組(感染陰性病毒液)和空白對照組(不做任何處理)，設(shè)置3個(gè)復(fù)皿，感染48 h后在倒置顯微鏡的熒光視野和明視野下觀察細(xì)胞感染狀態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測感染效率，感染效率=感染陽性細(xì)胞數(shù)/檢測總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-6 和TNF-α水平 上述3組感染48 h后的細(xì)胞上清液按IL-6和TNF-α檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，檢測IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。加樣，37℃溫育30 min，洗滌5次，加酶標(biāo)抗體50 μL，溫育、 洗滌，加顯色液顯色，檢測其吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IL-6和TNF-α的水平。

1.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞中IL-6 和TNF-α mRNA表達(dá)水平 3組細(xì)胞感染48 h后，棄除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，用 Trizol 法提取上述3組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR法檢測IL-6和TNF-α mRNA的相對表達(dá)水平，引物由上海生工生物有限公司合成。根據(jù)Ct值采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組Ct值-對照組Ct值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集3組樣本細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量為每毫升2×106個(gè)細(xì)胞，75%冰凍乙醇4 ℃過夜，重懸細(xì)胞后加入20 μL RNA酶，37℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶(PI)進(jìn)行DNA染色，輕輕混勻后4℃避光孵育60 min，使用BD流式細(xì)胞儀檢測，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ModFit LT軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察miR-124a過表達(dá)腺病毒感染J774.1細(xì)胞 miR-124a過表達(dá)腺病毒感染J774.1細(xì)胞48 h后，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明腺病毒成功有效地感染J774.1細(xì)胞(圖1，見插頁三)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞感染48 h后的感染效率 3組細(xì)胞感染48 h后，胰酶消化并收集，流式細(xì)胞儀分析腺病毒感染J774.1細(xì)胞的效率，結(jié)果顯示：空白對照組、miR-124a過表達(dá)組和空載腺病毒組感染效率分別為42.8%和45.1%。見圖2。

A: Blank control group B:Empty vector group C:miR-124a group.

Fig.2 Infection efficiencies of J774.1 cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 ELISA法檢測3組細(xì)胞感染48 h后細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平 3組細(xì)胞感染48 h后，ELISA法檢測結(jié)果顯示：miR-124a過表組細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組(P=0.038，P=0.042；P=0.043，P=0.044)。見表1。

表1 3組細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平

Tab.1 Levels of TNF-α and IL-6 in cell supernatant in three groups [n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

2.4 RT-PCR法檢測3組細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平 3組細(xì)胞感染48 h后，RT-PCR法檢測TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平：miR-124a過表達(dá)組細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組(P=0.001，P=0.002；P=0.001，P=0.003)。見表2。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組細(xì)胞感染48 h后不同細(xì)胞周期的細(xì)胞百分率 miR-124a腺病毒轉(zhuǎn)染J774.1細(xì)胞48 h，與空白對照組和空載腺病毒組比較，miR-124a過表達(dá)組G1期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.01)，S和G2期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)，表明miR-124a感染小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 細(xì)胞后可以阻滯細(xì)胞周期于G1期。見表3。

表2 3組細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平

Tab.2 Expression levels of TNF-α and IL-6 mRNA in cells in three groups (n=3,±s)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

表3 3組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率

Tab.3 Percentages of cells at different cell cycles in three groups (n=3,±s,η/%)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

3 討 論

RA是慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病，病變特點(diǎn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥、骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞日益嚴(yán)重，最后導(dǎo)致程度不等的功能障礙和畸形，病因至今仍未闡明，免疫失衡和過度炎癥可能是RA發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。近年來研究[13-14]顯示：輔助性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子可侵蝕破壞關(guān)節(jié)，巨噬細(xì)胞作為一種炎癥細(xì)胞，能夠產(chǎn)生高濃度的細(xì)胞因子和促炎介質(zhì)，從而加重炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞;巨噬細(xì)胞為RA的起始細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的損傷和激活會引起機(jī)體炎癥性反應(yīng)。小鼠巨噬細(xì)胞J774.1具有正常巨噬細(xì)胞功能，可以產(chǎn)生TNF-α和IL-6[15]。因此本研究選擇小鼠巨噬細(xì)胞J774.1作為RA研究的載體。體內(nèi)的Th1/Th2 輔助T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在體內(nèi)維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)，Th1細(xì)胞主要分泌 IFN-γ和TNF-α 等細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞分泌 IL-4和IL-6等細(xì)胞因子，然而在RA發(fā)生發(fā)展過程中這種平衡被破壞[16]。其中IL-6和TNF-α等重要促炎性細(xì)胞因子參與RA多種致病機(jī)制，人源化IL-6受體拮抗劑可以改善RA患者癥狀[17-18]。

miRNAs可通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子表達(dá)而減緩RA臨床癥狀，Yang 等[19]研究顯示：miR-124參與膽堿能抗炎通路，對全身和局部炎癥有明顯的抑制作用，α7煙堿型乙酰膽堿受體 (alph α7 nicotinic acetylcholine receptors, α7nAChR)通過調(diào)節(jié) miR-124 的表達(dá)，減少了IL-6 和TNF-α 的產(chǎn)生和釋放，miR-124通過靶蛋白 STAT3 來減弱 IL-6的產(chǎn)生，通過降低TNF-α轉(zhuǎn)化酶穩(wěn)定性來調(diào)節(jié) TNF-α蛋白表達(dá)。Qiu等[20]發(fā)現(xiàn)：miR-124是1個(gè)重要的炎癥相關(guān)miRNA，miR-124可抑制TLR通路中IL-1受體相關(guān)激酶1 (IL-1 receptor-associated kinase 1) 和TNF 受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6)，發(fā)揮抗炎作用。王易林等[21]發(fā)現(xiàn)：在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型上，活化的過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ) 通過上調(diào)miR-124 抑制小鼠肺組織炎性因子 IL-6和TNF-α 的表達(dá)，具有保護(hù)和防御急性肺損傷的作用。本研究結(jié)果顯示：小鼠巨噬細(xì)胞J774.1細(xì)胞感染48 h后，miR-124a過表達(dá)組細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6表達(dá)水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組，細(xì)胞中TNF-α 和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組,提示過表達(dá)的miR-124可以抑制RA細(xì)胞模型J774.1細(xì)胞炎性因子TNF-α和IL-6的釋放,從而減緩RA的病情迅速進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒感染J774.1細(xì)胞48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-124a腺病毒轉(zhuǎn)染J774.1細(xì)胞48 h后各組細(xì)胞的周期分布：miR-124a過表達(dá)組G1期細(xì)胞百分率與空載腺病毒組和空白對照組比較明顯升高，S和G2期細(xì)胞百分率明顯降低，提示miR-124a轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞J774.1細(xì)胞后可以阻滯細(xì)胞周期于G1期，miR-124a可能通過影響細(xì)胞周期的方式影響J774.1細(xì)胞的增殖。Nakamachi等[22]將miR-124a的前體轉(zhuǎn)染RA患者滑膜細(xì)胞后可以抑制其增殖，并阻滯細(xì)胞周期于G1期，miR-124a結(jié)合在細(xì)胞周期激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK-2) 和 單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)的3′端的非編碼區(qū)，抑制CDK-2和MCP-1的表達(dá)。

綜上所述，miR-124a抑制RA致病過程中重要炎癥介質(zhì)IL-6和TNF- α的分泌，并影響RA常用的細(xì)胞模型J774.1 細(xì)胞的增殖，在此推測miR-124a在RA發(fā)病中可能起著正調(diào)控作用，可能成為RA新的治療靶點(diǎn)，但目前對其作用機(jī)制了解尚少，還需進(jìn)一步深入探討。