馬晉芳，肖 雪，王雪利，彭 銀，史慶龍，蔣華壯，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；2.中山大學(xué)南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學(xué)廣州 510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006）

涼茶是我國(guó)人民在長(zhǎng)期預(yù)防疾病與保健的過程中，以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，以多種中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的飲料總稱[1-2]。

王老吉涼茶是著名的廣東涼茶之一，主要由金銀花、菊花、仙草、夏枯草、雞蛋花、布渣葉、甘草共七味藥材經(jīng)過現(xiàn)代工藝制造而成的一種用于清涼祛火，清熱解毒的現(xiàn)代涼茶產(chǎn)品[2]。涼茶中含有多種成分，其有效成分可能為總酚酸類成分[3]。咖啡酸是一種天然的酚類化合物，具有抗氧化、抗輻射等多種功能活性[4]。目前，對(duì)王老吉涼茶質(zhì)量研究較少，有報(bào)道采用液質(zhì)聯(lián)用法分析王老吉涼茶中的成分[5]。在王老吉涼茶的實(shí)際生產(chǎn)過程中，如果采用液質(zhì)聯(lián)用法或高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，分析結(jié)果存在滯后性，難以滿足在線分析的要求[6]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前近紅外在線光譜儀已實(shí)現(xiàn)技術(shù)成熟化、產(chǎn)業(yè)化，它能提供成分含量、物理化學(xué)性質(zhì)等多個(gè)內(nèi)在質(zhì)量參數(shù)的在線測(cè)量，從而為基于中藥內(nèi)在成分含量的質(zhì)量控制模式提供了技術(shù)支持。以近紅外在線光譜儀為核心設(shè)備，實(shí)現(xiàn)中藥生產(chǎn)過程在線檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的智能化控制將是中藥生產(chǎn)過程的大勢(shì)所趨，將成為中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)的核心技術(shù)[7-9]。為了進(jìn)一步提高王老吉涼茶藥材利用率、降低生產(chǎn)成本，因此，引入近紅外光譜技術(shù)，對(duì)涼茶生產(chǎn)工藝過程中的提取階段中總酚酸和咖啡酸的含量進(jìn)行研究。本研究采用近紅外光譜在線分析技術(shù)，結(jié)合偏最小二乘法，對(duì)王老吉涼茶中試提取過程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè)研究，為王老吉產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)提供有效支持。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

圖1 王老吉涼茶提取過程在線近紅外原始光譜

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；XS205 DuaLRange型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度計(jì)（島津（中國(guó)）有限公司）；Matrix-F近紅外光譜儀（德國(guó)布魯克公司）；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0（Demo），清華大學(xué)），在線監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)（THU NIR Online（Demo），清華大學(xué)）；中小型提取罐（30L）。乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)默克），甲酸、碳酸鈉（分析級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠）。福林酚溶液（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（110885-200102，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110831-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；王老吉涼茶混合藥材（廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司提供）。

1.2 樣品制備

提取罐中加入純化水200 L，開啟攪拌，用蒸汽將水加熱到煮沸，將已稱好的10 kg混合藥材投入提取罐中，在溫度90±2℃提取90 min，提取過程中進(jìn)行近紅外控制時(shí)每隔約2 min采樣一次，按樣品采集時(shí)間編號(hào)，并置于密封容器中存放。

1.3 在線近紅外采集光譜[10-11]

光譜采集條件：選用2 mm光程，以空氣為背景，采用透射模式在線采集提取液吸收光譜，光譜范圍為800-2 500 nm，掃描次數(shù)32次，分辨率2 nm，每個(gè)提取液樣品重復(fù)掃描3次，得出平均的光譜數(shù)據(jù)，采集的近紅外原始光譜見圖1。

1.4 王老吉涼茶提取液中指標(biāo)成分的含量測(cè)定

1.4.1 王老吉涼茶中總酚酸的含量測(cè)定[12]

1.4.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加水配制成0.645 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

取“1.2”項(xiàng)下樣品各5 mL，再加入5 mL蒸餾水，混勻即可。

1.4.1.3 測(cè)定方法

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液1 mL，加入1.8 mL福林酚試劑,室溫反應(yīng)5 min后加入1.2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，避光放置1.5 h后于765 nm下，以水為空白測(cè)定其吸光度。

1.4.2 王老吉涼茶中咖啡酸的含量測(cè)定[13-14]

1.4.2.1 色譜條件

色譜柱 phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流動(dòng)相體系：乙腈-0.3%乙酸水溶液；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.3%乙酸水溶液，梯度洗脫（0-20 min，7%-20%A；20-30 min，20%-95%A），流速為0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器DAD-3000，進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配制成濃度為0.214 mg·mL-1的咖啡酸母液。精密量取母液0.8 mL至5 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液。

1.4.2.3 供試品溶液的制備

取“1.2”項(xiàng)下樣品各5 mL，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液。

1.4.2.4 測(cè)定方法

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液各20 μL，經(jīng)HPLC測(cè)定。

1.5 樣本的在線監(jiān)測(cè)分析

采用THU NIR Online（Demo）對(duì)王老吉涼茶提取過程中的各個(gè)批次進(jìn)行分析比較，對(duì)光譜進(jìn)行波長(zhǎng)選擇，排除噪聲干擾，反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)成分的變化情況，選擇提取過程趨勢(shì)一致的批次進(jìn)行模型的建立與預(yù)測(cè)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將符合生產(chǎn)條件的樣本劃分為校正集、驗(yàn)證集及外部預(yù)測(cè)集，采用多種光譜預(yù)處理方法如無預(yù)處理、卷積平滑、一階卷積求導(dǎo)、二階卷積求導(dǎo)、歸一化法、多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換中的一種或幾種對(duì)光譜進(jìn)行優(yōu)化[15-18]。采用多種波長(zhǎng)選擇方法，如全波長(zhǎng)法、相關(guān)系數(shù)法、相關(guān)成分法、迭代優(yōu)化法等對(duì)光譜進(jìn)行波長(zhǎng)選擇[10,11,17]，采用偏最小二乘法對(duì)樣本的光譜數(shù)據(jù)與其性質(zhì)的含量值做回歸擬合計(jì)算，建立校正模型。

1.7 模型評(píng)價(jià)參數(shù)[19-20]

采用交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)偏差（SECV）、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差（SEC）、主因子數(shù)（LV）、決定系數(shù)（R2）作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)模型的性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液中總酚酸測(cè)定結(jié)果

根據(jù)測(cè)定方法中建立的UV-Vis法，對(duì)提取液中的總酚酸進(jìn)行含量測(cè)定，方法學(xué)主要參考中藥藥典和已報(bào)道過的文獻(xiàn)[12]，其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.82%、2.34%和0.25%，均小于3.0%，平均加樣回收率為97.64%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=1.4356X+0.0246，R=0.9995，各批次的提取液中總酚酸的測(cè)定結(jié)果見表1、表3、表5。

2.2 提取液中咖啡酸測(cè)定結(jié)果

根據(jù)測(cè)定方法中建立的液相方法，對(duì)提取液中的咖啡酸進(jìn)行含量測(cè)定，方法學(xué)主要參考中藥藥典和已報(bào)道過的文獻(xiàn)[13-14]，其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.97%，0.83%和2.97%，均小于3.0%，平均加樣回收率為98.57%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=78.9692X+0.0302，R=1.0000，各批次的提取液中咖啡酸的測(cè)定結(jié)果見表2、表4、表6。

2.3 各批次樣本的在線監(jiān)測(cè)分析

采用THU NIR Online（Demo）對(duì)王老吉涼茶提取過程中的六個(gè)批次進(jìn)行分析比較[21]，光譜波長(zhǎng)選擇為834-1830 nm，檢測(cè)目標(biāo)成分的變化情況，如圖2所示為第一批次趨勢(shì)變化圖，從左向右，趨勢(shì)逐漸趨于平衡，提示達(dá)到提取完全。通過比較各個(gè)批次，選擇提取過程趨勢(shì)一致的五個(gè)批次進(jìn)行模型的建立與預(yù)測(cè)分析。

2.4 樣本集的劃分

根據(jù)2.3中樣本的在線監(jiān)測(cè)分析結(jié)果，選出5批符合現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)條件的樣本進(jìn)行建模和驗(yàn)證分析，其中包括118個(gè)建模樣本，30個(gè)外部驗(yàn)證樣本，1個(gè)批次34個(gè)在線驗(yàn)證樣本。

2.5 近紅外模型的建立

2.5.1 光譜預(yù)處理

采用“1.6”中的光譜預(yù)處理方法，對(duì)所“1.3”中采集的建模原始光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理來消除基線漂移，提高信噪比，提取關(guān)鍵信息。本研究比較了幾種常用預(yù)處理方法，提高了模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表7，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R越接近1，內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差SECV越小，預(yù)處理方法越好。最終確定對(duì)總酚酸和咖啡酸分別進(jìn)行卷積平滑預(yù)處理，在其所有預(yù)處理方法中SECV最小，分別為0.0620和0.0010。

2.5.2 波長(zhǎng)的選擇方法

本研究中對(duì)總酚酸和咖啡酸的建模波段進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)合各成分中分子結(jié)構(gòu)的差異性，通過比較全波長(zhǎng)、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法，優(yōu)選最佳建模波段，并建立數(shù)學(xué)模型，確定近紅外光譜與含量的關(guān)系。結(jié)果顯示迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法能最大程度地利用光譜中的有效信息，并消除噪音等因素的影響，因此，對(duì)全波長(zhǎng)法、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法進(jìn)行比較（表8）。結(jié)果顯示迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法的相關(guān)系數(shù)最高，SECV值最小，所以，總酚酸和咖啡酸均選擇迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法建立定量模型。

2.5.3 模型維數(shù)的確定

本研究中采用偏最小二乘法建立定量模型，維數(shù)的選擇對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力有較大影響。在校正集樣本一定的情況下，維數(shù)過多，則會(huì)由于噪音偏大而出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象；維數(shù)過少則會(huì)由于包括的信息不完全導(dǎo)致模型的預(yù)測(cè)能力差。因此，本研究選擇兩個(gè)指標(biāo)成分的模型維數(shù)分別為4和6，結(jié)果見圖3。

2.5.4 模型的建立

在線提取液的近紅外光譜分別經(jīng)卷積求導(dǎo)預(yù)處理后，采用迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法，運(yùn)用偏最小二乘法分別建立定量校正模型并分析，結(jié)果顯示總酚酸和咖啡酸的相關(guān)系數(shù)分別為0.9759和0.9664，內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差SECV分別為0.0620和0.0010，具體模型的參數(shù)見下表。

2.6 模型的外部驗(yàn)證與在線驗(yàn)證

選取30個(gè)樣本作為外部驗(yàn)證集，34個(gè)樣本作為在線驗(yàn)證集，預(yù)測(cè)總酚酸和咖啡酸的含量，并與高效液相法測(cè)定值進(jìn)行比較，驗(yàn)證校正模型的準(zhǔn)確性，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的擬合結(jié)果見圖4，相關(guān)系數(shù)均大于0.85，說明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值相對(duì)吻合，可見總酚酸和咖啡酸的定量校正模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。

3 討論

通過建立的近紅外光譜校正模型，獲得的王老吉涼茶提取液中總酚酸和綠原酸近紅外預(yù)測(cè)值與HPLC測(cè)定值基本一致，且預(yù)測(cè)值的變化趨勢(shì)也與在線提取過程的含量相符合。結(jié)果證實(shí)了近紅外光譜在線技術(shù)在王老吉涼茶的中試提取過程中應(yīng)用的可行性，為下一步在王老吉涼茶的大生產(chǎn)過程中實(shí)施近紅外在線動(dòng)態(tài)質(zhì)量監(jiān)控提供了研究基礎(chǔ)。

此外，本實(shí)驗(yàn)采用同一批次的藥材作為研究對(duì)象，整體預(yù)測(cè)效果較好，但仍存在有個(gè)別異常光譜，分析原因，不排除提取過程中循環(huán)設(shè)備儀器引起的遮光現(xiàn)象。這也提醒在后續(xù)研究工作特別是在線過程分析中要充分考慮各種干擾因素。

表1 建模樣本中總酚酸含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表2 建模樣本中咖啡酸含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表3 外部驗(yàn)證集樣本中總酚酸的含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表4 外部驗(yàn)證集樣本中咖啡酸的含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表5 在線驗(yàn)證集樣本中總酚酸的含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表6 在線驗(yàn)證集樣本中咖啡酸的含量測(cè)定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

圖2 第一批次的總酚酸在線監(jiān)測(cè)分析圖

表7 光譜預(yù)處理方法的比較

表8 波長(zhǎng)選擇方法的比較

圖3 模型維數(shù)圖

表9 兩個(gè)成分的模型參數(shù)

圖4 定量校正模型外部驗(yàn)證與在線驗(yàn)證圖