錢森和王 洲魏 明薛正蓮

(1. 安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2. 安徽工程大學(xué)微生物制藥產(chǎn)業(yè)共性研究院，安徽 蕪湖 241000)

芝麻多肽是芝麻蛋白經(jīng)水解后得到的有生物活性的混合小肽，與蛋白質(zhì)相比，這些小肽易于被人體吸收利用，且具有抗氧化、抗菌、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等生理活性，其中抗氧化作用是其重要的一種生理活性[1-2]。研究[3]表明，芝麻多肽具有清除機(jī)體自由基、抑制脂質(zhì)過氧化以及提高抗氧化酶活性的能力，還能夠降低小鼠血清和肝臟中丙二醛含量，提高肝臟中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性。

美拉德反應(yīng)是羰基化合物與氨基化合物之間發(fā)生的一種復(fù)雜反應(yīng)。美拉德反應(yīng)對提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)以及食品品質(zhì)方面具有重要作用，通過美拉德反應(yīng)可以提高蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性以及膠體穩(wěn)定性[4]；改變食品的色澤、風(fēng)味以及營養(yǎng)價(jià)值[5]。研究[6]表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中含有類黑精、還原酮以及揮發(fā)性雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)具有一定的抗氧化性能。

目前采用美拉德反應(yīng)修飾生物活性肽的研究較多，例如：陳貴堂等[7]制備的灰樹花多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力和DPPH自由基清除能力與等質(zhì)量濃度的抗壞血酸相當(dāng)；趙謀明等[8]以草魚肽和木糖制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度更高、抗氧化活性更強(qiáng)，且隨時間的延長抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。然而，美拉德反應(yīng)用于改善芝麻多肽抗氧化活性的研究還未見報(bào)道。本研究在制備芝麻多肽的基礎(chǔ)上，篩選芝麻多肽美拉德反應(yīng)的適宜還原性糖及其肽糖比，研究美拉德反應(yīng)對芝麻多肽抗氧化活性的影響，以期提高芝麻多肽抗氧化活性；并進(jìn)一步分析芝麻多肽美拉德反應(yīng)過程中氨基酸組成及含量、褐變程度、接枝度以及紫外吸收光譜的變化，探討芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化的機(jī)理，為食品中天然抗氧化劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖、木糖、乳糖、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、乙酸鈉、三氯化鐵、雙氧水：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

堿性水解酶、三氯乙酸、鐵氰化鉀、DPPH、ABTS、鄰二氮菲等：分析純，上海青析化工有限公司；

鄰苯二甲醛、甲醇、乙腈：色譜純，美國Agilent Technologies公司；

芝麻粕：安徽華安食品有限公司；

分析天平：FC-104型，上海精密科學(xué)儀器公司；

微型高速粉碎機(jī)：FW100型，天津泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-6型，江蘇金壇市億通電子有限公司；

離心機(jī)：TGL-16型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

高校液相色譜儀： LC-20A型，日本島津公司；

紫外—可見光分光光度計(jì)：TU-1800型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芝麻多肽的制備 稱取50 g芝麻粕，粉碎后過60目篩，用 0.1 mol/L NaOH溶液在40 ℃恒溫水浴攪拌提取1 h，離心(8 000 r/min，10 min)后，取上清液(芝麻蛋白液)，在堿性蛋白酶(1.0×105U/g)與芝麻蛋白液(10%)的E/S為2%、pH 8.0、酶解溫度40 ℃條件下酶解3 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶20 min，冷卻后離心(8 000 r/min，10 min)，上清液冷凍干燥后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氨基酸含量測定 取1 mL多肽溶液，加入2 mL三氯乙酸沉淀蛋白后離心(12 000 r/min，10min)，經(jīng)0.22 μm 膜過濾后采用HPLC法進(jìn)行氨基酸含量的測定。色譜柱：Thermo Hypersil ODS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫40 ℃；流動相，水相A：無水醋酸鈉3.06 g，先溶于800 mL水，然后加三乙胺200 μL，四氫呋喃5 mL，ddH2O定容至1 L，醋酸調(diào)節(jié)pH至7.2，有機(jī)相B：無水醋酸鈉3.06 g，ddH2O 定容至200 mL，醋酸調(diào)節(jié)pH至7.2，然后加入400 mL 甲醇和400 mL 乙腈；流速1 mL/min。采用OPA 試劑進(jìn)行在線柱前衍生。

1.2.3 芝麻多肽美拉德反應(yīng)還原糖種類及肽糖比的確定

用蒸餾水將芝麻多肽配置成質(zhì)量濃度為5%的溶液，分別稱取一定量的葡萄糖、乳糖和木糖，加到芝麻多肽溶液中，使肽糖的質(zhì)量比分別為2∶1，1∶1，1∶2，1∶3。待完全溶解后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，置于95 ℃水浴2 h，反應(yīng)后迅速冷卻，得到芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 在選取適宜的還原糖和肽糖比的基礎(chǔ)上制備芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)條件同1.2.3，反應(yīng)時間分別為1，2，3，4 h。

1.2.5 抗氧活性測定

(1) 還原力的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法略作修改，取多肽溶液及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物各0.5 mL于試管中，加入0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1.0%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，于50 ℃保溫20 min后置于冰浴中，并加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后于3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2 mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，振蕩均勻后靜置10 min，測定其在700 nm 處的吸光值(A700)。

(2) ABTS+自由基清除率測定：根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法略作修改，取7.4 mmol/L ABTS溶液2 mL與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液2 mL，混合后室溫避光放置16 h，用pH 4.5的20 mmol/L 乙酸鈉緩沖溶液稀釋混合液，使其在734 nm處的吸光值(A734)達(dá)到0.7±0.02，取2.0 mL稀釋過的溶液與1 mL多肽液混合，靜置6 min后測定A734值。

(1)

式中：

EA——ABTS+自由基清除率，%；

A0——加入去離子水的吸光值；

As——加入樣品的吸光值。

(3) DPPH自由基清除率的測定：根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法略作修改，取1 mL樣品與4 mL 0.02 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，混勻后在室溫避光放置30 min，混合液于3 000 r/min 離心5 min，取上清液，測定517 nm處的吸光值(A517)，用體積比1∶1的無水乙醇與水混合液作為參比。

(2)

式中：

ED——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白對照(DPPH+乙醇)的吸光值；

A1——加入樣品時DPPH(樣品+DPPH-無水乙醇)的吸光值；

A2——樣品(樣品+乙醇)的吸光值。

(4) 羥自由基清除率測定：根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法略作修改，取7.5 mmol/L FeSO4溶液0.2 mL，7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液0.2 mL，樣品溶液0.4 mL，pH 7.4 PBS的溶液2.0 mL，蒸餾水0.8 mL 以及1.0% H2O20.4 mL于試管中，混勻后置于37 ℃ 恒溫水浴60 min，測定其在536 nm處的吸光值。

(3)

式中：

EOH——羥自由基的清除率，%；

A0——以蒸餾水代替樣品測得的吸光值；

A1——以蒸餾水分別代替樣品和H2O2測得的吸光值；

A2——樣品的吸光值。

1.2.6 褐變程度和接枝度的測定

(1) 褐變程度測定：根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法略作修改，以蒸餾水作為參比，在420 nm處測定芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值作為褐變程度。

(2) 接枝度測定：根據(jù)文獻(xiàn)[14]方法略作修改，取200 μL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL的芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，加入鄰苯二甲醛溶液4 mL，混勻后置于35 ℃條件下水浴2 min，測定其在340 nm的吸光值。空白對照組為4.0 mL鄰苯二甲醛+200 μL蒸餾水。

(4)

式中：

DG——接枝度，%；

At——芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在340 nm的吸光值；

A0——芝麻多肽溶液在相同反應(yīng)條件下在340 nm的吸光值。

1.2.7 紫外光譜分析 用0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液將芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，采用紫外-可見光分光光度計(jì)全波長掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理、作圖及統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和做圖，用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析，每個試驗(yàn)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖種類及肽糖比的確定

選取葡萄糖、乳糖和木糖3種代表性還原性糖與不同比例的芝麻多肽進(jìn)行美拉德反應(yīng)，研究糖的種類及肽糖比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，木糖與芝麻多肽發(fā)生美拉德反應(yīng)后產(chǎn)物的還原力最高，而乳糖最低；可能是木糖為五碳糖單糖，其碳鏈短于葡萄糖，空間位阻小，更易于多肽發(fā)生美拉德反應(yīng)；乳糖為還原性雙糖，其分子量較還原性單糖的分子量大，從而導(dǎo)致反應(yīng)速度較還原性單糖慢[15]。另外，隨著肽糖比例的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的還原力逐漸增加，當(dāng)肽糖質(zhì)量比<1∶2時，其還原力增加不明顯。因此，選取木糖與芝麻多肽1∶2的質(zhì)量比進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 還原糖種類及肽糖比例對芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響

圖1 Effect of reducing sugar types and peptide sugar ratios on reducing force of mallard reaction products of sesame polypeptide

2.2 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽鐵氰化鉀還原力的影響

芝麻多肽及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的鐵氰化鉀還原力見圖2。由圖2可知，芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力隨著反應(yīng)時間的延長明顯增大，在反應(yīng)前2 h內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物的還原力低于芝麻多肽；但在反應(yīng)3～4 h時，還原力分別為0.83，0.92，顯著高于芝麻多肽的還原力(P>0.05)。這與Jiang等[16]研究水溶性牛酪肽美拉德產(chǎn)物的還原力隨反應(yīng)時間延長而增加的結(jié)果相一致。

2.3 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽ABTS+自由基清除能力的影響

圖3為芝麻多肽及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ABTS+自由基清除率。由圖3可知，美拉德反應(yīng)能夠顯著提高芝麻多肽ABTS+自由基的清除能力，且反應(yīng)產(chǎn)物的ABTS+自由基清除率隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時間為3，4 h 時，自由基清除率分別為43%，72%，顯著高于芝麻多肽的清除率(P>0.05)。Zeng等[17]研究也表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有ABTS+自由基清除活性，且清除活性隨反應(yīng)時間的延長而增加。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖3 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽ABTS+自由基清除率的影響

圖3 Effect of mallard reaction on the ABTS+free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.4 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽DPPH自由基清除能力的影響

圖4為美拉德反應(yīng)對芝麻多肽DPPH自由基清除率的影響。由圖4可知，美拉德反應(yīng)能夠顯著提高芝麻多肽DPPH自由基的清除率，當(dāng)芝麻多肽美拉德反應(yīng)1～4 h時，產(chǎn)物的DPPH自由基清除率顯著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖4 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽DPPH自由基清除率的影響

圖4 Effect of mallard reaction on the DPPH free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.5 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽羥自由基清除能力的影響

美拉德反應(yīng)對芝麻多肽羥自由基清除率的影響見圖5。由圖5可知，在1～3 h內(nèi)，芝麻多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除能力隨著反應(yīng)時間的延長而增強(qiáng)，但反應(yīng)3，4 h自由基清除率差異不明顯。另外，在反應(yīng)2～4 h，產(chǎn)物的自由基清除率顯著高于芝麻多肽的(P>0.05)。

Sp表示芝麻多肽；*表示與Sp比較，差異在0.05水平上顯著圖5 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽羥自由基清除率的影響

圖5 Effect of mallard reaction on the hydroxyl free radical scavenging rate of sesame polypeptides

2.6 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽游離氨基酸含量的影響

圖6為美拉德反應(yīng)(4 h)對芝麻多肽游離氨基酸組成與含量變化。由圖6可以看出，芝麻多肽美拉德反應(yīng)后，體系中游離氨基酸含量發(fā)生了變化，含量明顯增加的氨基酸有丙氨酸、纈氨酸；含量明顯減少的氨基酸有賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸；其他氨基酸含量基本維持不變。另外，生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，可能是加熱使得部分小肽發(fā)生降解[18]。其中生成的天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，另外，半胱氨酸的生成也能提高體系的抗氧化活性。

圖6 美拉德反應(yīng)對芝麻多肽氨基酸組成和含量的影響

圖6 Effect of mallard reaction on the amino acid composition and contents of sesame polypeptides

2.7 美拉德反應(yīng)的褐變程度及接枝度變化

美拉德反應(yīng)褐變程度通常可以反映接枝反應(yīng)的速率，褐變程度越強(qiáng)，表明接枝反應(yīng)越快[19]。芝麻多肽美拉德反應(yīng)褐變度與接枝度變化見圖7、8。

圖7 芝麻多肽美拉德反應(yīng)褐變程度隨時間的變化

圖7 Changes in browning degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

圖8 芝麻多肽美拉德反應(yīng)接枝度隨時間的變化

圖8 Changes in grafting degree of sesame peptide mallard reaction as a function of reaction times

由圖7可知，芝麻多肽的褐變程度均隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，在反應(yīng)4 h時，其420 nm處吸光值為1.45。另外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)物顏色也逐漸加深，表明生成的類黑精也越來越多，其抗氧化活性越來越強(qiáng)[20]。

通過測定體系中自由氨基基團(tuán)含量變化，可以反映出美拉德反應(yīng)的進(jìn)程[21]。從圖8可以看出，芝麻多肽美拉德反應(yīng)的接枝度也隨時間延長而明顯增大，在4 h時其接枝度為26.4%。由此可知，芝麻多肽美拉德反應(yīng)的接枝度變化與褐變趨勢基本相符，接枝度變化能夠反映出褐變程度。

2.8 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外光譜

紫外光譜是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征與分析的重要手段，可以通過測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸收峰來判斷其結(jié)構(gòu)的變化。由圖9可以看出，芝麻多肽及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在210 nm左右具有較強(qiáng)的吸收峰，而這一吸收峰能夠表征肽鍵的變化。隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物吸收峰的最大值逐漸增大，與褐變程度和接枝度的變化相一致；且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其光譜發(fā)生了紅移現(xiàn)象，說明氨基酸基團(tuán)周圍微環(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性減弱，使得多肽的結(jié)構(gòu)變得更加松散[22]。另外，在260 nm處也有一吸收峰，這一吸收峰正是類黑精的特征，且隨著反應(yīng)時間的延長，其吸收峰的最大值也逐漸增加，表明隨著反應(yīng)的進(jìn)行生成的類黑精逐漸增多[23]。

圖9 芝麻多肽及其美拉德產(chǎn)物的紫外光譜掃描Figure 9 UV spectrum scanning of sesame polypeptide and its mallard products

3 結(jié)論

研究表明，芝麻多肽美拉德反應(yīng)的適宜肽糖質(zhì)量比為1∶2；美拉德反應(yīng)能夠提高芝麻多肽抗氧化活性，隨著反應(yīng)時間的延長，其還原力、ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力以及羥自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。美拉德反應(yīng)改變了芝麻多肽中游離氨基酸組成和含量，生成的酸性氨基酸具有一定的抗氧化活性。芝麻多肽美拉德反應(yīng)的褐變程度和接枝度隨著反應(yīng)時間的延長而增大，其產(chǎn)物的顏色逐漸加深，表明生成的產(chǎn)物逐漸增多。紫外光譜掃描分析表明，芝麻美拉德反應(yīng)能夠改變芝麻多肽的肽鍵，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，特征峰的吸光值逐漸增多，表明生成的類黑精物質(zhì)逐漸增多。美拉德反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，影響其產(chǎn)物抗氧化活性的因素較多，在后期的工作中將進(jìn)一步深入研究。