徐文泱 陳 華

(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410017)

光引發(fā)劑是紫外光印刷油墨中非常重要的組成部分，它受紫外光照射后，吸收光的能量，分裂成2個(gè)活性自由基，引發(fā)光敏樹脂和活性稀釋劑發(fā)生連鎖聚合，使膠黏劑交聯(lián)固化，作為油墨固化的催化劑被廣泛用于紫外光油墨的印刷包裝上[1]。常見的小分子光引發(fā)劑主要分為水性均裂碎片型光引發(fā)劑和水性氫轉(zhuǎn)移型光引發(fā)劑。前者有水性安息香衍生物類(如安息香、安息香雙甲醚、安息香乙醚、安息香異丙醚、安息香丁醚)、苯乙酮衍生物(如α，α-二乙氧基苯乙酮、α-羥烷基苯酮、α-胺烷基苯酮、二苯基乙酮、α，α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮)以及烷基苯酮類，水性氫轉(zhuǎn)移型光引發(fā)劑的代表化學(xué)結(jié)構(gòu)為蒽醌、硫雜蒽酮以及二苯甲酮，其中水性二苯甲酮類又可按其在二苯甲酮母核引入的基團(tuán)分為陽離子、陰離子和非離子類型[2]。光引發(fā)劑因其合成較為簡單，品種多樣，價(jià)格低廉而備受市場的青睞。

但由于光引發(fā)劑是溶脂性小分子物質(zhì)，極易從包裝材料遷移到食品中，造成食品污染[3]。已有報(bào)道證實(shí)食品中也能檢測出二苯甲酮、異丙基硫雜蒽酮等光引發(fā)劑[4]。試驗(yàn)[5-6]表明光引發(fā)劑苯甲酮可增加罹患腫瘤、尿道下裂的風(fēng)險(xiǎn)，引發(fā)多種過敏性皮膚病。因此，食品中多種光引發(fā)劑檢測方法的建立可以為此類污染物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支持，提高食品質(zhì)量安全監(jiān)管能力，健全預(yù)警應(yīng)急機(jī)制。

目前關(guān)于光引發(fā)劑的檢測方法以食品包裝材料方向居多[7-9]。劉艷等[10]建立了塑料及紙塑類包裝材料中9種光引發(fā)劑的氣相色譜質(zhì)譜法。在食品中檢測光引發(fā)劑的方法研究相對較少，主要集中在乳制品及飲料中光引發(fā)劑的檢測[11-13]上。前處理方法主要有固相萃取、固相微萃取技術(shù)和QuEChERS方法等，使用的儀器多為氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀。張耀海等[11]研究了8種光引發(fā)劑在橙汁、蘋果汁、桃汁、菠蘿汁和涼茶5種食品中的GC/MS-MS檢測方法，結(jié)果表明，方法的回收率偏差較大，最低為60.4%，最高達(dá)到99.1%，結(jié)果的相對偏差最高接近16%。另有文獻(xiàn)[12]采用GC-MS法對乳制品中的異丙基硫雜蒽酮檢測方法進(jìn)行了報(bào)道，檢出限在0.007 mg/kg左右。

由于光引發(fā)劑多為脂溶性小分子物質(zhì)，其向高脂高蛋白的食品中遷移概率更高。本研究擬選取14種有代表性的酮、醚、酯類光引發(fā)劑，拓展了研究食品種類，針對肉類、乳制品、糕點(diǎn)等高油富含蛋白質(zhì)的食品，著力于建立一種靈敏度高、選擇性好，回收率和精密度等技術(shù)參數(shù)均能達(dá)到方法學(xué)指標(biāo)要求的高通量GC-MS檢測方法，以同時(shí)檢測出高脂食品中的14種光引發(fā)劑，為研究此類光引發(fā)劑的遷移規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-氯噻噸酮、苯甲酰甲酸甲酯、2-苯甲酰苯甲酸甲酯、2-甲基二苯甲酮、4-氯-二苯甲酮、四乙基米氏酮、2-羥基-甲基苯丙酮、2，4-二乙基硫雜蒽-9-酮、3甲基-二苯甲酮、米氏酮、4-甲基二苯甲酮、安息香二甲醚、二苯甲酮、對二甲氨基苯甲酸異辛酯：99%，德國Dr Ehrenstorfer公司；

丙酮、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

HLB小柱：60 mg，3 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

PSA試劑管：2 mL(150 mg MgSO4，50 mg PSA，50 mg GCB，50 mg C18)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

試驗(yàn)用食品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 7890A-5975C MSD型，美國安捷倫科技公司；

高速冷凍離心機(jī)：Neofuge 1600R型，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；

分析天平：SPS401F型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

渦混振蕩儀：CM-1000型，東京理化器械株式會社。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 19091S-433(30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱流速：1 mL/min。進(jìn)樣量：1 μL；程序升溫條件：初始溫度為60 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至180 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃保持5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 EI 源。離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，分別采用SCAN模式和SIM模式，在整個(gè)確認(rèn)試驗(yàn)中，14種光引發(fā)劑的色/質(zhì)譜圖信息見表1。針對檢測的光引發(fā)劑品種多，保留時(shí)間相對集中的特點(diǎn)，在選擇掃描離子時(shí)考慮以下幾個(gè)原則：① 盡量選擇豐度高的碎片離子；② 選擇的監(jiān)測離子扣除背景后，其信噪比應(yīng)盡量大于3。

當(dāng)試樣待測液保留時(shí)間和目標(biāo)化合物一致(±0.5%)，其質(zhì)譜碎片離子質(zhì)荷比吻合，豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品的偏差符合表2，則可對試樣待測液中的光引發(fā)劑進(jìn)行定性確認(rèn)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱量14種標(biāo)樣各0.1 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，稀釋溶劑為丙酮，各光引發(fā)劑母液濃度為10 g/L。分別移取0.1 mL母液于100 mL容量瓶中，以丙酮定容至刻度，此為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，各光引發(fā)劑的濃度均為10 μg/mL。系列工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品前處理 將樣品勻質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取2～5 g(精確至0.000 1 g)，以20 mL丙酮—正己烷(體積比2∶8)提取，渦混振蕩15 min后，于4 000 r/min離心5 min，取上清液加入到活化后的HLB小柱，以10 mL丙酮—正己烷進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮至近干以丙酮定容到2 mL，移取1 mL到PSA凈化管中，離心后上機(jī)。

表1 14種光引發(fā)劑的保留時(shí)間和質(zhì)譜中的選擇離子及豐度比Table 1 Retention time and selected ion of 14 photoinitiators

表2氣相色譜—質(zhì)譜定性確證相對離子豐度最大容許誤差

Table 2 The maximum allowable error of relative ion abundance by gas chromatography-mass spectrometry %

相對豐度GC-MS相對離子豐度最大允許誤差(50,∞)±10(20,50]±15(10,20]±20[0,10]±50

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了2種不同的色譜程序升溫條件:

(1) 60 ℃保持1 min，以20 ℃/min到150 ℃保持1 min，再以2 ℃/min 升到270 ℃保持8 min。

(2) 60 ℃保持 1 min，以 20 ℃/min 到 240 ℃ 保持0 min，再以2 ℃/min 到 270 ℃保持25 min。

從圖1、2可以看到，在第(1)種程序升溫條件下14種光引發(fā)劑僅出現(xiàn)了9個(gè)峰，且苯甲酰甲酸甲酯和2-羥基-甲基苯丙酮的2峰分離度差，在第(2)種程序升溫條件下14種光引發(fā)劑均能出峰，但峰與峰過于緊密，影響定量分析。因此將第(2)種程序升溫條件進(jìn)行改進(jìn)。將出峰較多的前段升溫程序放緩，即當(dāng)60 ℃保持1 min后，以10 ℃/min 到120 ℃保持2 min，再以5 ℃/min 到240 ℃保持5 min，以2 ℃/min升溫至270 ℃保持15 min。由圖3可以看到，14種光引發(fā)劑均能檢測出，并且峰形良好，分離度較佳。

圖1 程序升溫條件(1)的總離子流圖

圖1 GC-MS chromatogram of the mixture of 14 photoinitiators with 1stcolumn temperature programme

圖2 程序升溫條件(2)的總離子流圖

圖2 GC-MS chromatogram of the mixture of 14 photoinitiators with 2ndcolumn temperature programme

14種光引發(fā)劑均為脂溶性化合物，而高脂高蛋白食品種類繁多，基質(zhì)相對復(fù)雜。而采用氣/液相質(zhì)譜聯(lián)用儀定量分析復(fù)雜基質(zhì)中化合物含量時(shí)應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)。將空白樣品經(jīng)過前處理的提取凈化以及濃縮至近干后，分別加入相同體積不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩離心后即得相應(yīng)質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按式(1)對基質(zhì)效應(yīng)的程度進(jìn)行評估。當(dāng)ME≥20%時(shí)，需考慮基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果準(zhǔn)確度帶來的影響。由表3可知，ME均小于20%，在定量分析中無需考慮基質(zhì)效應(yīng)。可以看到本試驗(yàn)前處理?xiàng)l件下測得的光引發(fā)劑檢出限低于文獻(xiàn)[14]報(bào)道，對目標(biāo)物的痕量檢測具備一定優(yōu)勢。

圖3 程序升溫條件(3)的總離子流圖

圖3 GC-MS chromatogram of the mixture of 14 photoinitiators with 3rdcolumn temperature programme

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)，%；

M1——基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率；

M2——純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2.2 提取條件的確認(rèn)

選取的14種光引發(fā)劑酮類、酯類結(jié)構(gòu)居多，并有少量硫醚類物質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)[15-17]及其化學(xué)性質(zhì)，選取甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及乙腈為參考提取溶劑。在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中發(fā)現(xiàn)，2-氯噻噸酮不溶于甲醇和乙腈，改選用極性稍弱的丙酮和乙酸乙酯。由于乙酸乙酯的出峰時(shí)間早于苯甲酰甲酸甲酯的出峰時(shí)間，導(dǎo)致了它可能被乙酸乙酯的溶劑峰覆蓋，且硫醚類物質(zhì)在乙酸乙酯溶液中不穩(wěn)定。因此，初步選擇丙酮為試驗(yàn)的提取溶劑。由于高脂食品易發(fā)生乳化現(xiàn)象，在用有機(jī)溶劑萃取前先加入少量氯化鈉以達(dá)到破乳的目的。已有研究[14]表明，非極性溶劑和中等極性溶劑的結(jié)合使用有利于提高目標(biāo)提取物的穩(wěn)定性，并且有效地促進(jìn)目標(biāo)物和雜質(zhì)的分離。因此，選取體積比1∶1的丙酮—正己烷、丙酮—石油醚和丙酮—二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行回收率試驗(yàn)。提取和凈化操作按1.3.4進(jìn)行，圖4為不同的提取溶劑與回收率關(guān)系示意圖。

表3 14種光引發(fā)劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 3 Linear equation, correlation coefficients, linearity range and LOD of 14 photoinitiators

圖4 不同的提取溶劑對回收率的影響Figure 4 Effects of different solvents on the recoveries

由圖4可知，丙酮—正己烷對14種光引發(fā)劑的平均回收率最高。進(jìn)一步建立正交試驗(yàn)法考察萃取條件。分別選取提取溶劑的體積比、萃取溫度、提取時(shí)間作為萃取條件的3個(gè)影響因素，設(shè)計(jì)了三因素三水平正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4。試驗(yàn)結(jié)果和極差分析見表5。

結(jié)果表明，丙酮的比例減少有利于回收率的提高，可能是提取效率較高，在提取了目標(biāo)物的同時(shí)雜質(zhì)也較易溶在此溶劑中。由表5可知，最佳提取條件為丙酮和正己烷體積比2∶8，萃取溫度20 ℃，提取時(shí)間15 min。按該條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，光引發(fā)劑的平均回收率為93.1%，優(yōu)于其他試驗(yàn)條件所得的回收率，因此確認(rèn)提取條件為以丙酮—正己烷(體積比2∶8)為提取溶劑，20 ℃下提取15 min即可最大效率地提取出所有目標(biāo)化合物。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 吸附劑的選擇 QuEChERS方法是分散固相萃取技術(shù)的衍生和發(fā)展，其核心成分是N-丙基乙二胺吸附劑。目前，在食品及包裝材料中光引發(fā)劑檢測的報(bào)道中用到此類凈化方法的較多[11,18]。由于本試驗(yàn)中食品基質(zhì)較為復(fù)雜，采用單一的QuEChERS方法進(jìn)行凈化可能無法取得較為理想的凈化效果。因此，嘗試采用HLB小柱和QuEChERS技術(shù)相結(jié)合的模式進(jìn)行凈化，以達(dá)到去除基質(zhì)干擾，降低檢出限的目的。由圖5可以看出，單采用QuEChERS方法凈化在加標(biāo)濃度較低時(shí)的回收率大部分均低于采用兩者相結(jié)合的方法進(jìn)行凈化的。HLB柱中的吸附劑是親水親脂平衡聚合物，它的作用基團(tuán)是苯基、乙烯基和吡咯烷酮基，應(yīng)用機(jī)理是通過非極性的相互作用來保留目標(biāo)物。在其凈化的基礎(chǔ)上用PSA進(jìn)行下一步凈化以去除碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和色素，可有利于提高凈化效果，去除基質(zhì)的干擾，也能提高方法靈敏度，達(dá)到痕量分析的目的。圖5的回收率也可顯示將這兩種凈化吸附劑結(jié)合起來使用效果最優(yōu)。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 5 Orthogonal experiment result

2.3.2 過柱體積 由于固相萃取柱容積的局限性，需要在盡可能對樣品體積進(jìn)行濃縮的前提下保證萃取效率。因此，試驗(yàn)對由丙酮—正己烷提取后的上清液在進(jìn)行HLB過柱凈化時(shí)的溶液體積也進(jìn)行了考察。分別選用15，30，50 mL待凈化溶液過柱，考察不同體積對待測化合物回收率的影響。當(dāng)過柱體積為30 mL時(shí)，所有的待測物回收率處于3種水平中的最高值。當(dāng)溶液為50 mL時(shí)，所有的待測物回收率均有所下降。而當(dāng)待凈化溶液為15 mL時(shí)，米氏酮和四甲基米氏酮的回收率相比30 mL時(shí)的下降最為明顯，達(dá)到了30%以上。

圖5 3種凈化方法對樣品中14種光引發(fā)劑加標(biāo)回收率的影響

圖5 Effects of three purification methods on the recoveries of 14 photoinitiators in the spiked samples

2.4 回收率和精密度

為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確度和精密度，選取了3個(gè)有代表性的濃度做加標(biāo)試驗(yàn)，進(jìn)行6次平行樣測試，方法的回收率和精密度見表6。由表6可知，RSD均<10%，在3個(gè)濃度下的加標(biāo)回收率均滿足GB/T 27404—2008 對方法確認(rèn)技術(shù)參數(shù)的要求。本試驗(yàn)中14種光引發(fā)劑的回收率為73.0%～92.4%，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～8.9%。

表6 14種光引發(fā)劑的加標(biāo)回收率及精密度Table 6 The recoveries and RSD of 14 photoinitators

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用本方法對40個(gè)樣品(代表基質(zhì)為酸奶、牛奶、臘肉和面包)進(jìn)行了檢測，共有2個(gè)牛奶樣品分別檢測出了二苯甲酮和2-氯噻噸酮，其他樣品中均未檢出光引發(fā)劑。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定高脂高蛋白食品中14種光引發(fā)劑的方法。方法采用HLB固相萃取小柱和PSA凈化管進(jìn)行聯(lián)合凈化。所得的方法檢出限為0.02～0.20 μg/kg，14種光引發(fā)劑的回收率為73.0%～92.4%，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，方法的檢出限低，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度較高。從方法前處理到檢測結(jié)果的確認(rèn)少于3 h，實(shí)現(xiàn)了14種光引發(fā)劑在此類食品中的快速高效檢測。下一步將圍繞食品類別與光引發(fā)劑檢出及含量關(guān)系進(jìn)行研究，并擴(kuò)大食品類別及光引發(fā)劑的種類對方法的適用性進(jìn)行進(jìn)一步評估。