伍 強(qiáng)萬 常彭娟娟曾 豪余有貴

(1. 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2. 邵陽市釀酒工程技術(shù)研究中心，湖南 邵陽 422000)

獼猴桃果酒除含一定乙醇外，還富含各種氨基酸、肽類及糖類、VC等成分，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、抗菌消炎等保健功效[1]，但該功效究竟與哪些活性成分有關(guān)，目前尚未得到表征。

ACE抑制肽是一類具潛在降血壓功效的小分子物質(zhì)，具備安全高效、人體易吸收等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于食物中本身存在的天然ACE抑制肽研究甚少，通常采用定向酶解技術(shù)制備食源性小肽[2]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)利用微生物制成的發(fā)酵產(chǎn)品中含有活性較強(qiáng)的天然ACE抑制肽，其中Kleekayai等[3]發(fā)現(xiàn)經(jīng)傳統(tǒng)自然發(fā)酵法制成的泰國蝦醬中含有2種ACE抑制肽(Ser-Val和Ile-Phe)；Wang等[4]利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆粕獲得ACE抑制肽，測得其活性IC50為22 μg/mL；Nejati等[5]接種乳酸乳球菌DIBCA2制成發(fā)酵乳，獲得IC50為5 μg/mL 的ACE抑制肽；Wang等[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的豆豉中富含ACE抑制肽，并指出霉菌發(fā)酵過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)影響ACE抑制活性，目前國內(nèi)外尚未見果酒ACE抑制肽的研究報(bào)道。

本研究擬以大湘西野生獼猴桃為菌種分離源，通過分離篩選和分子生物學(xué)鑒定，旨在獲得一株適用于獼猴桃果酒發(fā)酵的優(yōu)勢野生酵母菌，并初步研究該菌株純種發(fā)酵過程中ACE抑制活性、多肽濃度及酒精度的動態(tài)變化，為開發(fā)大湘西野生獼猴桃降血壓型保健果酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌分離源：湖南邵陽綏寧野生獼猴桃；

對照菌株：安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司；

酵母26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增引物NL-1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)、NL-4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇)：北京六合華大基因有限公司；

CTAB、TE、蛋白酶K、PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶：北京寶杰羅生物科技有限公司；

果膠酶：酶活50 000 U/g，河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；

培養(yǎng)基所有試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基[7]；

WL培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，溴甲酚綠0.022 g，磷酸二氫鉀0.55 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鉀0.425 g，酵母浸粉4.0 g，硫酸鎂0.125 g，硫酸錳0.002 5 g，氯化鐵0.002 5 g，氯化鈣0.125 g，瓊脂20.0 g，用蒸餾水定容至1 L，pH為6.5，高溫121 ℃滅菌20 min[8]；

獼猴桃培養(yǎng)基：選八成熟、發(fā)軟的野生獼猴桃，清洗干凈，打漿，加入0.10 g/100 g果膠酶攪拌均勻，在35 ℃酶解3 h，取上清液于68 ℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器設(shè)備

單人單面垂直凈化工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；

數(shù)碼顯微鏡：BA310型，麥克奧迪(廈門)實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

打漿機(jī)：JYL-C012型，九陽股份有限公司；

pH計(jì)：EL20型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1780型，日本島津儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：JI54DWS型，致微(廈門)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分離 根據(jù)柴洋洋等[9]的方法修改如下：無菌稱取10 g新鮮的野生獼猴桃，置于無菌研缽中研成果漿，轉(zhuǎn)移至裝有90 mL無菌水的三角瓶，混合均勻后置于28 ℃ 培養(yǎng)24 h。以無菌水對該漿液進(jìn)行梯度稀釋，吸取10-1稀釋液2 μL涂布于YEPD分離培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)3 d。挑選典型的酵母單菌落平板劃線，繼代2次獲得純化菌種，用JM1、JM2、JM3、……依次編號，觀察菌落形態(tài)特征。

1.4.2 釀酒酵母的篩選 挑選YEPD分離培養(yǎng)基上具有單菌落、表面光滑突起、呈奶油色的菌株，在10×80倍顯微鏡下鏡檢，觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，對多端出芽繁殖的酵母菌株進(jìn)行初篩。

采用WL培養(yǎng)基從初篩的酵母菌株中篩選出釀酒酵母[8]，將酵母菌株分別劃線接種于WL培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d 后，選擇顏色為乳白色、球形突起、表面光滑不透明、平板上有酒香的菌株。

將篩選的釀酒酵母活化后，以3 mL/100 mL接種量(種子液濃度1.0×108個/mL)接種于獼猴桃培養(yǎng)基上，調(diào)整起始pH為3.6，起始糖度160 g/L，于28 ℃發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵醪液的ACE抑制活性及酒精度，以安琪果酒酵母作為對照，篩選出發(fā)酵能力較強(qiáng)并具有ACE抑制活性的釀酒酵母。

1.4.3 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)牛廣財(cái)?shù)萚10]的方法修改如下：取純化菌株于研缽中液氮研磨，加入600 μL TE充分懸浮菌體，加入10% SDS 250 μL，倒轉(zhuǎn)混勻后加入20 ng/μL 蛋白酶K 3 μL，于37 ℃水浴1 h。依次加入5 mol/L NaCl 150 μL、2% CTAB 150 μL，于65 ℃水浴20 min。12 000 r/min離心20 min，取上清液加入等體積異丙醇，放置30 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取沉淀加入70%酒精750 μL，充分懸浮后12 000 r/min、4 ℃離心2 min，取沉淀加入30 μL(含Rnase，10 ng/μL)，4 ℃溶解過夜。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系(30 μL)：Taq聚合酶(5 U/L)0.2 μL，PCR緩沖液3 μL，dNTP混合液(25 mmol/L)2 μL，引物NL-1(10 mol/L)3 μL，引物NL-4(10 mol/L)3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O定容至30 μL。將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行26S rDNA D1/D2測序，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對(BLAST)。

1.4.4 發(fā)酵醪液的ACE抑制活性 將分離篩選獲得的釀酒酵母接種于獼猴桃培養(yǎng)基，調(diào)整起始糖度為160 g/L，起始pH為3.6，在28 ℃下進(jìn)行純種發(fā)酵。分別在不同發(fā)酵階段(0，2，4，6，8，10 d)取100 mL發(fā)酵醪液，根據(jù)余有貴等[11]的方法，采用密度儀測定其酒精度。4 000 r/min離心15 min，測定發(fā)酵醪液上清液的ACE抑制率和多肽濃度。

1.4.5 ACE抑制率的測定 參照Wu等[12]的方法。

1.4.6 多肽濃度的測定 根據(jù)Wu等[13]的方法修改如下：將發(fā)酵醪液上清液與10 g/100 mL的三氯乙酸(TCA)水溶液等體積混合后靜置10 min，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液用福林—酚法測定吸光值，計(jì)算多肽濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化與篩選

經(jīng)初步分離，獲得12株符合條件的酵母菌菌株，分別標(biāo)記為JM1～JM12。如表1所示，通過菌落形態(tài)觀察和細(xì)胞形態(tài)鏡檢，發(fā)現(xiàn)JM1、JM2、JM3、JM4、JM5、JM6、JM11、JM12菌落均呈白色，顯微鏡下觀察細(xì)胞多呈圓形、橢圓形，其中JM1、JM11、JM12菌落較大、呈奶白色、表面光滑突起[圖1(a)]，細(xì)胞呈圓形[圖1(b)]。利用WL培養(yǎng)基對8株菌株作進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)差異明顯，JM1、JM11、JM12菌落呈乳白色、球形突起、表面光滑不透明[圖1(c)]，平板上有酒香，將其初步擬定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；JM2、JM3菌落中央呈深綠色、邊緣呈淡綠色，扁平、表面光滑不透明，呈黃油狀，屬于葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)；JM4、JM5、JM6菌落呈鮮綠色，菌落很小、表面光滑不透明、呈黃油狀，屬于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyccspombe)。

表1 野生獼猴桃酵母菌的分離篩選Table 1 Isolation and screening of yeast strains from wild kiwifruit

圖1 野生獼猴桃釀酒酵母菌JM11的形態(tài)特征

圖1 Morphological characteristics ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

選取JM1、JM11、JM12對獼猴桃培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，比較三者的產(chǎn)酒量及ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)JM11發(fā)酵醪液的酒精度最高(5.6%Vol)，ACE抑制率較強(qiáng)(69.4%)。對JM11作進(jìn)一步分子生物學(xué)鑒定，以驗(yàn)證該野生酵母菌為釀酒酵母。

2.2 釀酒酵母的分子生物學(xué)鑒定

利用引物NL-1與NL-4對該釀酒酵母26S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖2所示，瓊脂糖凝膠電泳顯示該擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量約為550 bp。

野生獼猴桃酵母菌JM11的DNA測序結(jié)果如圖3所示，將該序列提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與Saccharomycescerevisiae(MG547774.1)序列相似性最高，為90%。結(jié)合該菌株的YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基等菌落特征和顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察，確定所篩選的野生獼猴桃酵母菌JM11屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

M. 標(biāo)準(zhǔn)Maker JM11. PCR產(chǎn)物圖2 野生獼猴桃釀酒酵母菌JM11的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 Electrophoretogram of PCR product ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

2.3 釀酒酵母發(fā)酵醪液的ACE抑制活性

如圖4所示，隨著野生獼猴桃釀酒酵母純種發(fā)酵的進(jìn)行，該發(fā)酵醪液中多肽濃度呈先上升后下降的趨勢，ACE抑制率則先上升后趨于平緩。酒精度不斷上升，盡管在第6天時酒精度高達(dá)9.5%Vol，但在發(fā)酵第4天時，ACE抑制率由發(fā)酵前的32.6%上升至93.0%，多肽濃度也達(dá)到最高值(2 652.0 μg/mL)，說明在野生獼猴桃經(jīng)自然發(fā)酵后產(chǎn)生了活性較強(qiáng)的ACE抑制劑，其活性高于箭魚魚卵[14]、墨魚[15]、鴨皮[16]等食源性ACE抑制劑。

真菌在生長過程中可分泌蛋白酶，將蛋白質(zhì)降解為氨基酸或短肽[17]。酵母為適應(yīng)環(huán)境變化，胞內(nèi)會出現(xiàn)應(yīng)激蛋白，與此同時也會分泌胞外蛋白作為一種信號載體或分泌蛋白酶來應(yīng)對環(huán)境的變化[18]，釀酒酵母[19]和純生啤酒酵母[20]在特定發(fā)酵條件下可分泌蛋白酶A酶原、蛋白酶A。因此，本研究推測在該發(fā)酵過程中野生酵母菌分泌蛋白酶，降解獼猴桃果肉蛋白，從而產(chǎn)生ACE抑制活性較強(qiáng)的肽類物質(zhì)。為證實(shí)推測，后期課題組將進(jìn)一步對發(fā)酵醪液中可能存在的ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，并研究該活性肽在野生獼猴桃純種發(fā)酵過程中的形成機(jī)理。

圖3 野生獼猴桃酵母菌JM11基因序列Figure 3 Nucleotide sequence of yeas JM11 from kiwifruit

圖4 野生獼猴桃不同發(fā)酵階段醪液中ACE抑制活性的測定

圖4 Determination of ACE inhibitory activity of wine fermentation liquor of wild kiwifruit

3 結(jié)論

利用平板劃線、YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基及顯微鏡觀察對野生獼猴桃酵母菌進(jìn)行分離篩選及初步鑒定，發(fā)現(xiàn)野生獼猴桃酵母菌共有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、路氏類酵母(Saccharomycordesludwoggi)、紅酵母(Rhodotorular)、全美梅氏酵母(Metschnicowiapulcherrima)5類，分別編號為JM1～JM12，其中JM1、JM11、JM12被鑒定為釀酒酵母。利用ACE抑制活性、酒精度等指標(biāo)對酵母菌JM1、JM11、JM12作進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)JM11發(fā)酵醪液表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACE抑制活性，并測得酒精度為5.6%Vol，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，確定野生獼猴桃酵母菌JM11為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。利用酵母菌JM11對野生獼猴桃進(jìn)行純種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵過程中產(chǎn)生了活性較強(qiáng)的ACE抑制劑，該物質(zhì)是否為ACE抑制肽，仍有待進(jìn)一步確認(rèn)。