李丹彬 張 靜 陳東戎

(復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院RNA生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032 )

NAD+和NADH是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶[1]。細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)特別是 NAD+/NADH比值直接影響著細(xì)胞的節(jié)律、衰老、癌變和死亡。近年來(lái),細(xì)胞內(nèi)與NAD+和NADH相關(guān)的物質(zhì)代謝研究倍受關(guān)注。

乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)能以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)為輔酶介導(dǎo)伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)。2003年,Tsukiji等[2]發(fā)現(xiàn),具有與ADH相似催化功能的核酶ribox02與反應(yīng)底物(苯甲醇/苯甲醛)之間的空間距離足夠接近且在NAD+與Zn2+同時(shí)存在時(shí)ribox02能催化苯甲醇反應(yīng)生成苯甲醛,同時(shí)NAD+被還原為NADH;之后又發(fā)現(xiàn)核酶ribox02能夠在NADH和Zn2+同時(shí)存在時(shí)催化苯甲醇生成苯甲醛,而NADH被氧化生成NAD+,即ribox02 RNA 能以NAD+和NADH為輔酶催化苯甲醛與苯甲醇之間的可逆反應(yīng)[3],且以NADH為輔酶生成醇的速度比以NAD+為輔酶催化生成醛的速度快[2-3]。研究人員通過(guò)觀察突變后ribox02的活性變化來(lái)推測(cè)酶活性位點(diǎn)[2-4],間接驗(yàn)證法所得結(jié)果與mfold預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)相結(jié)合獲得ribox02的二級(jí)結(jié)構(gòu)。但該二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)自于間接推測(cè),真實(shí)結(jié)果有待驗(yàn)證。通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)獲得ribox02全部活性的最小功能單位,去除66U～79G區(qū)域序列可使酶活性全部喪失,敲除L4序列也能大大降低酶活性,而去除或突變?cè)揜NA其他位點(diǎn)并未對(duì)酶活性產(chǎn)生明顯影響,因此預(yù)測(cè) ribox02 與輔酶小分子的結(jié)合位點(diǎn)可能位于GU序列較為豐富的J1/4區(qū),而ribox02與NAD+和NADH的作用位點(diǎn)及結(jié)合機(jī)制尚不明確。

選擇性2-OH酰基化學(xué)探測(cè)法(selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE)是基于FAM 引物引導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)探測(cè)技術(shù)[5],非配對(duì)的核苷酸的 2’-OH 相比于配對(duì)的或其他限制性的核苷酸更容易受到親核攻擊,而NMIA 作為一種羥基選擇性化學(xué)試劑能更迅速地與非配對(duì)的 RNA 核苷酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物。逆轉(zhuǎn)錄酶可在酰基復(fù)合物形成位點(diǎn)特異性終止延伸反應(yīng),從而產(chǎn)生特異性長(zhǎng)度的 FAM-cDNA 熒光信號(hào),而未經(jīng)NMIA修飾的核苷酸位點(diǎn)FAM-cDNA的信號(hào)則處于本底水平。根據(jù)cDNA熒光信號(hào)的強(qiáng)度,可推測(cè)出 RNA各個(gè)核苷酸的配對(duì)情況,從而直接精確探測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

等溫滴定量熱法(isothermal titratio calorimetry,ITC)是通過(guò)檢測(cè)樣品池補(bǔ)償功率的變化來(lái)擬合計(jì)算結(jié)合常數(shù)及結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù),在類似于化學(xué)滴定的過(guò)程中跟蹤化學(xué)反應(yīng)的熱流隨時(shí)間的變化[6-7],可用于檢測(cè)NAD+、NADH與ribox02的特異性結(jié)合。

紫外交聯(lián)技術(shù)(UV-crosslinking)的原理是基于紫外照射能激發(fā)核酸上的堿基,處于激發(fā)態(tài)的堿基能與數(shù)埃范圍內(nèi)含有不飽和雙鍵的抗生素發(fā)生交聯(lián)結(jié)合,且這種結(jié)合是不可逆的共價(jià)交聯(lián)[8],通過(guò)帶FAM熒光引物引導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可得到抗生素結(jié)合在RNA上的位置信息,從而精準(zhǔn)定位NAD+、NADH與核酶ribox02的特異性結(jié)合位點(diǎn)。

本研究旨在揭示核酶ribox02與NAD+、NADH特異性結(jié)合的位點(diǎn)及其結(jié)合力性質(zhì),以期為核酶ribox02的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

資 料 和 方 法

質(zhì)粒和菌株質(zhì)粒pGEx-4T-1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,大腸埃希菌JM109購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

試劑氨芐青霉素;LB培養(yǎng)基;LB固體培養(yǎng)基;1%胰蛋白酶;0.5%酵母提取液;1%氯化鈉;1.5%和1%瓊脂糖凝膠;1 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH=8.0);0.5 mol/L乙二胺四乙酸;3 mol/L醋酸鈉;1 mol/L 二硫蘇糖醇;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷;40%(w/v)丙烯酰胺;5×體外轉(zhuǎn)錄緩沖液;200 mmol/L 3-羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽;0.1%(v/v)聚乙二醇辛基苯基;100 mmol/L氯化鎂;10 mmol/L亞精胺;5×TBE電泳緩沖液(pH=8.3):500 mmol/L 3-羥甲基氨基甲烷,400 mmol/L H3BO3,10 mmol/L乙二胺四乙酸;EK 緩沖液(pH=8.0):50 mmol/L 4-羥乙基哌嗪丙磺酸,500 mmol/L 氯化鉀,100 mmol/L氯化鎂,0.5 mmol/L氯化鋅。

分子克隆ribox02 RNA 序列:3’-GGG-AUCGUCAGUGCAUUGAGAUGUUUCUCAGA-CUGAUUAUCGUGAGACAGUGAUCUCGUGG-UCAGUCCUAGUUUGGGGGCUGGUCCUCACG-GUGGUAUCCCCAAGGGGUA-5’;ribox02-linke RNA序列:3’-GGGAUCGUCAGUGCAUUGAG-AUGUUUCUCAGACUGAUUAUCGUGAGACA-GUGAUCUCGUGGUCAGUCCUAGUUUGGGG-GCUGGUCCUCACGGUGGUAUCCCCAAGGGG-UAUCGAUCCGGUUCGCCGGAUCCAAAUCGG-GCUUCGGUCCGGUUC-5’。

ribox02是經(jīng)過(guò)隨機(jī)組合篩選出來(lái)的RNA序列,無(wú)模板,故通過(guò)引物退火延伸獲得該序列,ribox02的DNA序列加上保護(hù)堿基,酶切位點(diǎn)以及T7序列后所得序列如下:3’-CTAGTCTAGATA-ATACGACTCACTATAGGGGGGATCGTCAGT-GCATTGAGATGTTTCTCAGACTGATTATCG-TGAGACAGTGATCTCGTGGTCAGTCCTAGT-TTGGGGGCTGGTCCTCACGGTGGTATCCCCA-AGGGGTAGGATCCGCG-5’ (保護(hù)堿基+XbaⅠ+T7 seq+ribox02 seq+BamHⅠ+保護(hù)堿基)。

將待研究序列放入Helix Systems的DNA Works中,得到合成ribox02序列所需的寡核苷酸片段:Oligos 1:3’-CTAGTCTAGATAATACGACTCA-CTATAGG-5’;Oligos 2:3’-CAATGCACTGAC-GATCCCCCCTATAGTGAGTCGTATTATCTAG-ACT-5’;Oligos 3:3’-GGGGATCGTCAGTGCA-TTGAGATGTTTCTCAGACTGATTATCG-5’;Oligos 4:3’-AGGACTGACCACGAGATCACT-GTCTCACGATAATCAGTCTGAGAAACATCT-5’;Oligos 5:3’-TGATCTCGTGGTCAGTCCTA-GTTTGGGGGCTGGTCCTCACGGTGGTATCCC-CA-5’;Oligos 6:3’-CGCGGATCCTACCCCTTG-GGGATACCACCGTGA-5’。

退火延伸得到的DNA片段與載體質(zhì)粒pGEx-4T-1中加入內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ,37 ℃反應(yīng)1.5 h。分別加入4 μL 10×上樣緩沖液,將酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離,割膠回收;0.3 pmol DNA片段與0.03 pmol載體在T4 DNA 連接酶作用下進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌JM109中,涂板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,第2天挑取單菌落測(cè)序,測(cè)序正確的單克隆菌株體內(nèi)所含質(zhì)粒即可作為體外轉(zhuǎn)錄RNA的DNA模板。

體外轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的引物以及帶有連接片段linker的引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)錄模板。PCR體系:2 μL ribox02上游引物,2 μL linker下游引物,0.5 μL質(zhì)粒模板,25 μL 2×Phanta SF反應(yīng)緩沖液,4 μL dNTP混合物,1 μL Phanta聚合酶,18.5 μL H2O。反應(yīng)過(guò)程:95 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。乙醇沉淀PCR產(chǎn)物,適量水溶解PCR產(chǎn)物作為轉(zhuǎn)錄體系的模板。500 μL轉(zhuǎn)錄體系:50 μL 10×轉(zhuǎn)錄緩沖液,5 μL二硫蘇糖醇(1 mol/L),112.5 μL rNTP混合物(25 mmol/L),25 μL DNA 模板(700 ng/μL),12.5 μL RNA核酶抑制劑,50 μL T7 RNA 聚合酶,245 μL超純水。37 ℃反應(yīng)過(guò)夜,加1 μL脫氧核酶Ⅰ(500 U/μL),37 ℃反應(yīng)1 h;加入等體積甲酰胺(含溴酚藍(lán)和二甲苯氰),95 ℃變性5 min,冰上保存待用。

SHAPE和紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄引物延伸反應(yīng)來(lái)展示,而引物延伸會(huì)使RNA的5’端的引物結(jié)合部位信息缺失,因此SHAPE和紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)所用的ribox02-linker RNA與ITC實(shí)驗(yàn)所用的ribox02 RNA不一樣,ribox02-linker RNA的下游引物前面加上一段不會(huì)影響RNA折疊的linker 序列。ribox02上游引物:3’-TAATACGA-CTCACTATAGGGGGGA-5’;ribox02下游引物:3’-TACCCCTTGGG-GATACCACCG-5’;ribox02-linker下游引物:3’-GAACCGGACCGAAGCCC-GATTTGGATCCGGCGAACCGGATCGATACC-CCTTGGGGATACCACCGTGAGG-5’。ribox02上游引物作為通用引物,可用于2種RNA的合成體外轉(zhuǎn)錄體系中。ribox02上游引物與ribox02下游引物作為一對(duì)引物,合成的ribox02為后續(xù)ITC實(shí)驗(yàn)所用;ribox02上游引物與ribox02-linker下游引物作為一對(duì)引物,合成的ribox02-linker為后續(xù)SHAPE實(shí)驗(yàn)及紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)所用。

純化RNA配置12%的變性聚丙烯酰胺凝膠,電壓1 200 V,功率70 W,預(yù)電泳30 min直至玻璃膠板高于50 ℃,上樣,電泳6 h;脫膠置于保鮮膜上,以熒光板為背景,暗室操作,紫外燈照射發(fā)光,254 nm下核酸條帶呈黑色;切下條帶,切碎后放入50 mL康寧管中,加入約20 mL含醋酸鈉(0.3 mol/L,pH=5.2)和EDTA(1 mmol/L,pH=8.0)的透析緩沖液,4 ℃震蕩4 h,析出RNA;取溶液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾除去聚丙烯酰胺膠顆粒,剩余膠帶進(jìn)行第2次透析;透析后的溶液用乙醇沉淀,加入1/10體積的醋酸鈉(3 mol/L,pH=5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇,-80 ℃放置30 min,4 ℃下9 000×g離心15 min,棄上清;加入600 μL預(yù)冷的75%乙醇,4 ℃下9 000×g離心5 min,棄上清(重復(fù)上述步驟),室溫晾干制成RNA干粉,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SHAPE法用EK緩沖液溶解RNA干粉,根據(jù)260 nm處的吸光度(D)值來(lái)配置10 pmol/μL的ribox02-linker RNA,取1 μL RNA(10 pmol/μL)加入去核糖核酸酶的EP管中,加入17 μL EK緩沖液;4 ℃離心30 s,使溶液到達(dá)1.5 mL EP管底部,95 ℃變性5 min,自然冷卻至室溫,加入1 μL NMIA,37 ℃反應(yīng)1 h;75%乙醇洗2次,晾干后用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。沉淀RNA中依次加入8 μL miliQ-H2O,2 μL特定的引物(10 μmol/L),5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(4 μL),RNA marker反應(yīng)體系還需加2 μL ddNTP (10 mmol/L),4 ℃離心30 s,65 ℃加熱5 min,取出后置于冰上,4 ℃離心30 s,EP管內(nèi)加入1 μL二硫蘇糖醇(0.1 mol/L)、0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ、0.5 μL核酶抑制劑(40 U/μL),混勻,55 ℃反應(yīng)1 h;加入1 μL NaOH(4 mol/L),95 ℃變性5 min,冰上快速冷卻,乙醇沉淀。用19 μL H2O溶解RNA沉淀,取1 μL用于ABI自動(dòng)測(cè)序儀3730進(jìn)行測(cè)序,采用Peak Scanner軟件V1.0分析結(jié)果。

ITC法配制合適濃度的小分子和RNA:電子天平稱取NAD+和NADH各0.066 g分別溶于1 mL的EK緩沖液中,配制成母液(100 mmol/L),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋。500 μL 轉(zhuǎn)錄體系獲得的干粉 RNA 用 500 μL EK緩沖液溶解,根據(jù) RNA 在260 nm處的D值計(jì)算 RNA 濃度,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用EK緩沖液進(jìn)行稀釋,稀釋后的RNA在95 ℃變性5 min,退火復(fù)性。小分子和RNA在4 ℃下9 000×g離心1 min,去氣泡。至少設(shè)置另外3個(gè)空白滴定實(shí)驗(yàn):配體滴緩沖液、緩沖液滴大分子溶液和緩沖液滴緩沖液。取60 μL樣品加入0.2 mL離心管中進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn),加樣時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,設(shè)置樣品池溫度為25 ℃,間隔時(shí)間為120 s,滴定針數(shù)為20,實(shí)驗(yàn)完成后采用Origin 7.0處理數(shù)據(jù)。

紫外交聯(lián)技術(shù)根據(jù)260 nm處的D值來(lái)配置10 pmol/μL RNA,取1 μL RNA于去核糖核酸酶的EP管中,加入EK緩沖液(去鎂離子),使體積達(dá)到18 μL;短暫離心,使溶液到達(dá)1.5 mL EP管底部,95 ℃加熱5 min,無(wú)干擾退火至室溫,加入1 μL MgCl2(2 mmol/L),25 ℃反應(yīng)30 min;加入1 μL各濃度梯度的NAD+和NADH,25 ℃反應(yīng)30 min;在冰盒中打開(kāi)EP管,254 nm紫外光下照射5 min;反應(yīng)結(jié)束后用75%乙醇洗2次,晾干,沉淀RNA用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄與SAHPE逆轉(zhuǎn)錄操作步驟相同。

結(jié) 果

ribox02RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的探測(cè)在ribox02序列的SHAPE實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,未經(jīng)NMIA修飾與經(jīng)過(guò)NMIA修飾的RNA所產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)信號(hào)明顯不同。未經(jīng)修飾的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后在各個(gè)核苷酸位點(diǎn)不呈現(xiàn)FAM-cDNA的熒光信號(hào)差異,圖1A中紅色測(cè)序信號(hào)為ribox02 RNA經(jīng)過(guò)NMIA修飾后的逆轉(zhuǎn)錄信號(hào),黑色測(cè)序信號(hào)(作為對(duì)照樣本)為RNA未經(jīng)化學(xué)試劑修飾所產(chǎn)生的信號(hào)圖,可見(jiàn)紅色測(cè)序信號(hào)有7個(gè)信號(hào)明顯較高的區(qū)域,即非配對(duì)單鏈區(qū)域。我們根據(jù)SHAPE數(shù)據(jù)結(jié)果繪測(cè)出ribox02 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1B)。

NAD+、NADH與ribox02RNA的相互作用因NADP+和NADPH的化學(xué)性質(zhì)、吸收光譜、氧化還原形式等均與NAD+和NADH相似,故選取NADP+和NADPH作為陰性對(duì)照(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未公布)。一定濃度的NAD+和NADH分別滴定ribox02,數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 7.0軟件處理。由ITC反應(yīng)中補(bǔ)償功率隨時(shí)間變化的曲線圖以及反應(yīng)熱隨摩爾比變化的曲線圖中可看出,NADH能與ribox02 RNA進(jìn)行迅速而有效的特異性結(jié)合(圖2A),平衡解離常數(shù)高達(dá)2.92×107±8.35×106(表1),而NAD+(圖2B)與NADH相比,呈現(xiàn)出較弱的親和力。由此可見(jiàn),NADH與ribox02能更快、更有效地識(shí)別結(jié)合并催化反應(yīng)。

對(duì)ITC原始數(shù)據(jù)反應(yīng)熱函數(shù)用One Set of Sites模型進(jìn)行擬合,這些結(jié)合參數(shù)包括結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、焓變、熵變和化學(xué)計(jì)量比。此外,根據(jù)Ross等[9]的熱力學(xué)規(guī)律:ΔH0≥0且ΔS0>0,為疏水作用力;ΔH0<0且ΔS0>0,為靜電作用力;ΔH0<0且ΔS0<0,為范德華力或氫鍵作用,可以推斷NAD+、NADH與ribox02 RNA結(jié)合的作用力都為范德華力或氫鍵作用。

圖1 ribox02 RNA的SHAPE實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(B)Fig 1 SHAPE result of ribox02 RNA (A) and its secondary structure probed by SHAPE (B)

MicromoleculeKd (/mol)ΔH (cal/mol)ΔS(cal/deg) NADH2.92×107± 8.35×106-2.05×104±274.2-36.4NAD+9.15×103±2.18×104-1.472×104±1.681×104-32.4

The upper curver showed compensation power changed with time in isthermal titration reaction,and the lower curver showed reaction heart changed with molar ratio.A:160 μmol/L NADH titraced 16 μmol/L ribox02 RNA;B:400 μmol/L NAD+tritraced 40 μmol/L ribox02 RNA.Reaction condition:25 ℃,a total of 20 needle,2 μL/needle,intervel of 120 s.

圖2ITC所得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin7.0處理后的曲線圖
Fig2GraphofITCdateprocessedbyOrigin7.0

紫外交聯(lián)技術(shù)探測(cè)NAD+、NADH與ribox02RNA的特異性結(jié)合位點(diǎn)ribox02 RNA分別與NADH、NAD+、NADP+和NADPH進(jìn)行紫外交聯(lián)(圖3),逆轉(zhuǎn)錄后測(cè)序得到信號(hào)峰;其中藍(lán)色信號(hào)為 RNA 自我交聯(lián)的背景值,紅色信號(hào)為 RNA 與小分子交聯(lián)產(chǎn)生的信號(hào)峰。由圖3A、3B可見(jiàn)23G～25U、38U、72U～75G和95G這9個(gè)位點(diǎn)的信號(hào)值在加入小分子NAD+、NADH后均有明顯上升,這說(shuō)明NAD+、NADH與RNA在上述位點(diǎn)結(jié)合并被交聯(lián),對(duì)于NADP+、NADPH 并未檢測(cè)到交聯(lián)位點(diǎn),這與ITC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。對(duì)比圖3A和圖3B,NADH所引起的信明號(hào)的改變比NAD+所引起的信號(hào)改變更為明顯,這也從側(cè)面驗(yàn)證了ITC實(shí)驗(yàn)所預(yù)測(cè)的結(jié)論,即相較于NAD+,NADH與ribox02能更快速而有效地識(shí)別結(jié)合并催化反應(yīng)。在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上NAD+、NADH與ribox02的紫外交聯(lián)位點(diǎn)如圖4所示。

Blue signal:Background of RNA self crosslinking;Red signal:RNA crosslinking with the small molecules.

圖3ribox02RNA與NADH、NAD+、NADPH和NADP+的紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Fig3Theresultofribox02RNAcrosslinkedwithNADH,NAD+,NADPHandNADP+

圖4NAD+/NADH與ribox02的紫外交聯(lián)位點(diǎn)在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上的圖示
Fig4UV-crosslinkingbindingsitesofNAD+/NADHonthesecondarystructureofribox02RNA

討 論

ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)小分子NADH和NAD+能與ribox02 RNA結(jié)合,即在空間位置上小分子能夠與ribox02 RNA處于無(wú)限靠近的距離,而NADH、NAD+、NADP+和NADPH分子結(jié)構(gòu)上都含有不飽和雙鍵,紫外交聯(lián)反應(yīng)能夠使得小分子不可逆地以共價(jià)鍵的形式交聯(lián)在RNA上,經(jīng)交聯(lián)的RNA通過(guò)FAM熒光引物引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在交聯(lián)位點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄會(huì)終止,通過(guò)測(cè)序可知交聯(lián)位點(diǎn)就是NAD+、NADH與ribox02 RNA的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合紫外交聯(lián)數(shù)據(jù)和SHPEA所探測(cè)到的ribox02 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)分析發(fā)現(xiàn):(1)小分子與RNA的9個(gè)結(jié)合位點(diǎn)23G、24U、25U、38U、72U、73U、74U、75G和95G均為G/U,并未出現(xiàn)A/C,這是因?yàn)镹AD+和NADH分子內(nèi)含有腺嘌呤殘基,根據(jù)搖擺堿基對(duì)原則,NAD+和NADH更容易與G、U結(jié)合。(2)所有的結(jié)合位點(diǎn)均位于RNA的頸環(huán)結(jié)構(gòu),這是因?yàn)轭i環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基在空間上更有利于與小分子進(jìn)行結(jié)合。(3) L2區(qū)域中的72U～75G位點(diǎn)是NAD+、NADH的主要結(jié)合位點(diǎn)之一,這一結(jié)果也解釋了P4/L2區(qū)域之所以能夠顯著影響ribox02的酶活性,但主要結(jié)合位點(diǎn)并非位于Tsukiji等[2]預(yù)測(cè)的J1/4,而是位于L2區(qū)域72U～75G。(4) 這9個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都存在于最小功能單位compact ribox02里,因此compact ribox02具有核酶ribox02的所有功能。(5)38U和95G是NAD+和NADH的重要結(jié)合位點(diǎn)。Tsukiji等[2]發(fā)現(xiàn)突變38U～40U和92G～94G對(duì)ribox02酶活性的影響很大,解釋為38U～40U和92G～94G應(yīng)處于配對(duì)狀態(tài),但這一推測(cè)并不嚴(yán)謹(jǐn),結(jié)合SHAPE的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)38U～40U和92G～94G處于非配對(duì)狀態(tài),而該區(qū)域之所以能影響ribox02的活性,是因?yàn)?8U與95G是NAD+和NADH的重要結(jié)合位點(diǎn)。(6) 輔酶小分子NAD+、NADH與RNA的結(jié)合位點(diǎn)主要分布在二級(jí)結(jié)構(gòu)上,并不十分靠近L1、L2和J1這3個(gè)區(qū)域。這是因?yàn)槿魏蜶NA尤其是功能性RNA,在溶液中的結(jié)構(gòu)絕不止二級(jí)結(jié)構(gòu)這樣簡(jiǎn)單,RNA會(huì)折疊為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)形式以行使其生物學(xué)功能。由小分子與RNA的結(jié)合位點(diǎn)可以推測(cè),P4和L2借助J3面向L1彎曲折疊,與J1部位形成了一個(gè)三維空間“口袋”,從而為NADH和NAD+的特異性結(jié)合提供了空間可能性。

核酶可特異性與靶分子mRNA結(jié)合并促進(jìn)mRNA裂解,且裂解完畢后自行脫離,再與其他靶分子RNA結(jié)合,因此可在不影響宿主細(xì)胞RNA的條件下,特異性結(jié)合并切割病毒RNA。利用核苷酸序列特異的酶切活性不僅可以研究特定基因的功能,也可利用此特點(diǎn)來(lái)尋找疾病治療的新靶標(biāo)。鑒于核酶具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小和易于合成并設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn),可望開(kāi)發(fā)出具有治療作用的核酶制劑。目前已有不少核酶已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段(如腫瘤治療和AIDS治療等)。