高洪芳 施志斌

摘要： 通過二硝基水楊酸（DNS）法測定淀粉水解的葡萄糖產(chǎn)率，并用響應(yīng)面法建立硫酸濃度、淀粉濃度和水解時間等因素與葡萄糖產(chǎn)率之間的數(shù)學(xué)關(guān)系模型，得出硫酸濃度為4.52mol/L、水解時間為10.28min、淀粉濃度為23.5mg/mL時葡萄糖產(chǎn)率最高，計(jì)算值與實(shí)際值分別為82.48%和81.55%，二者相似程度達(dá)98.87%。

關(guān)鍵詞： 淀粉水解； 二硝基水楊酸法； 葡萄糖產(chǎn)率； 響應(yīng)面法； 實(shí)驗(yàn)探究

文章編號： 10056629（2018）8006905 中圖分類號： G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： B

1 引言

現(xiàn)行三個版本的高中化學(xué)必修、選修教材中，均多次出現(xiàn)淀粉水解實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)通常還用于傳授實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思想——完全不水解、部分水解和完全水解等不同情況的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。但在實(shí)際演示過程中，往往容易發(fā)生“異常現(xiàn)象”，或不易出現(xiàn)“完全水解”的現(xiàn)象[1]。

淀粉在酸的催化作用下，先后生成糊精、低聚糖和麥芽糖等不完全水解產(chǎn)物，最終水解為葡萄糖[2]。根據(jù)淀粉完全水解的反應(yīng)方程式為： （C6H10O5）n+nH2OnC6H12O6，筆者嘗試用二硝基水楊酸法（以下簡稱為DNS法）測定淀粉水解后的葡萄糖產(chǎn)率，通過響應(yīng)面法考察反應(yīng)條件對水解產(chǎn)率的影響，尋找實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件。

2 實(shí)驗(yàn)探究

2.1 實(shí)驗(yàn)原理簡介

2.1.1 DNS法

在堿性條件下，DNS與還原糖共熱后生成3氨基5硝基水楊酸，該產(chǎn)物顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，可以用比色法測定還原糖含量。

2.1.2 響應(yīng)面法

響應(yīng)面法是通過DesignExpert軟件對反應(yīng)條件與反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，找出最佳反應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)方法。響應(yīng)面設(shè)計(jì)法可以建立連續(xù)變量與響應(yīng)值的曲面模型，從而可以連續(xù)地對實(shí)驗(yàn)的各個水平進(jìn)行分析。其與正交設(shè)計(jì)等設(shè)計(jì)方法相比，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測好、省時省力等優(yōu)勢[3～6]。

2.2 儀器、藥品及溶液制備

儀器： 分光光度計(jì)（島津UV1800型）、恒溫水浴鍋、電子天平（梅特勒托利多AL104型）

藥品： 可溶性淀粉（國藥集團(tuán)AR級，下同）、3，5二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、氫氧化鈉、碘

DNS試劑的制備： 準(zhǔn)確稱取18.2g酒石酸鉀鈉，溶于50mL蒸餾水中，45℃水浴加熱，于熱溶液中依次加入3，5二硝基水楊酸0.63g，氫氧化鈉2.1g，苯酚0.5g，攪拌至完全溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100mL，貯于棕色瓶中，室溫保存[7]。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的制備： 分別精確稱取20、 30、 50、 70、 90、 100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，配成標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（濃度分別為0.20、 0.30、 0.50、 0.70、 0.90、 1.00，單位： mg/mL）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

精確稱取一定質(zhì)量的淀粉，溶于10mL一定濃度的硫酸溶液中，水浴加熱一定時長后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至中性，水定容至20mL。取定容后的溶液1mL，利用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖DNS比色法測定還原性糖含量，并計(jì)算葡萄糖產(chǎn)率。

葡萄糖產(chǎn)率=溶液中還原糖質(zhì)量/水解所用淀粉質(zhì)量×100%

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

各取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3mL DNS試劑，沸水浴10min后取出，待其恢復(fù)至室溫時加蒸餾水補(bǔ)足至20mL，于波長540nm處測定吸光度值。建立還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 樣品中還原糖含量測定

將中和后的水解溶液稀釋若干倍，取1mL稀釋后樣品加入3mL DNS試劑，沸水浴10min取出至室溫，加入蒸餾水補(bǔ)足至20mL，于波長540nm處測定吸光值，根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算出水解后溶液中還原糖的含量。

2.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

前期單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫酸濃度為4mol/L，水解時間為10min，淀粉濃度為25mg/mL時，葡萄糖產(chǎn)率較高。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以A（硫酸濃度）、B（水解時間）和C（淀粉濃度）為自變量，以葡萄糖產(chǎn)率為響應(yīng)值（Y），采用BoxBehnken設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，因素編碼和水平如表1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

在實(shí)驗(yàn)條件下，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以540nm波長處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.820x-0.053， R2=0.9988，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 模型擬合及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇硫酸濃度、水解時間、淀粉濃度為響應(yīng)因素，以水解率為響應(yīng)值，利用BoxBehnken原理設(shè)計(jì)15組實(shí)驗(yàn)，其中包括3個中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，以DesignExpert 8.0.6為例，打開軟件選擇Response Surface項(xiàng)下的BoxBehnken選項(xiàng)卡，輸入因素名稱、單位及水平，點(diǎn)擊Continue，輸入響應(yīng)變量及單位，即完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

3.2.2 因素交互作用

通過BoxBehnken法所得到的多元二次回歸模型及其響應(yīng)面圖和等高線圖，可用于評價單因素對葡萄糖產(chǎn)率影響的兩兩交互作用，可以確定各個因素之間的最佳水平范圍。在交互作用的分析中，我們可以結(jié)合響應(yīng)面的3D圖和等高線圖來分析各個因子的交互作用以及單個因素的影響水平。其中，在等高線圖中，若等高線圖呈圓形說明兩者交互作用不顯著；若等高線圖呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著。在3D曲面分析中，若某一因素坡度較陡，說明此因素影響顯著；若某一因素坡度較緩，說明此因素影響較小[8， 9]。

圖2～圖4直觀地給出了各個因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等高線分析圖，軟件操作中，我們?nèi)赃x擇analysis選項(xiàng)下Model Graphs選項(xiàng)，即可顯示各個因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等高線分析圖。

由圖2可以看出，當(dāng)硫酸濃度一定時，葡萄糖產(chǎn)率隨著水解時間增長呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當(dāng)水解時間一定時，葡萄糖產(chǎn)率隨著硫酸濃度增高呈現(xiàn)先上升后降低趨勢。等高線圖成圓形，說明兩者交互作用不顯著，曲面圖中可以看出硫酸濃度曲面較陡峭，且硫酸濃度沿軸向等高線較為密集，說明硫酸濃度較水解時間顯著，與表3中數(shù)據(jù)相符。

采用同樣方法分析淀粉濃度與硫酸濃度，以及淀粉濃度與水解時間因素的交互作用。由圖3可以看出淀粉濃度與硫酸濃度兩者交互作用顯著，且硫酸濃度較淀粉濃度顯著。由圖4可以看出淀粉濃度與水解時間兩者交互作用顯著，且水解時間較淀粉濃度顯著。

3.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對擬合的回歸方程分別求解，得到最佳參數(shù)： 硫酸濃度為4.52mol/L、水解時間為10.28min、淀粉濃度為23.5mg/mL。在此條件下，葡萄糖產(chǎn)率為82.48%。

為方便起見，選擇4.5mol/L硫酸、23mg/mL淀粉溶液，水浴10min為實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前后，均對淀粉溶液取樣并用碘水測試。水解前的淀粉溶液遇碘水變藍(lán)，水解后（冷卻至室溫）溶液則不變藍(lán)。葡萄糖實(shí)際產(chǎn)率為81.55±0.61%，與計(jì)算值接近程度達(dá)98.87%。

4 結(jié)語

按前述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行淀粉水解的演示操作，可以順利得到理想的現(xiàn)象。但意外的是，葡萄糖產(chǎn)率不論是計(jì)算值，抑或?qū)嶒?yàn)值，均大幅低于100%。可能的原因有很多，如淀粉水解過程發(fā)生副反應(yīng)，或葡萄糖在加熱條件下轉(zhuǎn)化為糠醛、有機(jī)酸等物質(zhì)……具體是何種原因所致，需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)，如液相色譜等。

中學(xué)化學(xué)教材中仍有一些演示現(xiàn)象不理想、多因素控制的反應(yīng)，也可以運(yùn)用相應(yīng)面法進(jìn)行條件優(yōu)選，如乙酸乙酯的制取、銅與濃硫酸的反應(yīng)等。因此，本文通過響應(yīng)面法探究淀粉水解實(shí)驗(yàn)的條件優(yōu)化，希望能起到拋磚引玉的作用，與同行探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]王俏俏.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象“異?！保?非失敗，而是不可預(yù)測——以探究“淀粉水解實(shí)驗(yàn)”中的“異?！爆F(xiàn)象為例[J].化學(xué)教與學(xué)， 2017，（10）： 54，85～86.

[2]李東軍.微波條件下淀粉酸水解制備葡萄糖的研究[D].北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院碩士學(xué)位論文，2004： 3～6.

[3]張南生，孫衛(wèi)軍，郭虹等.BoxBehnken Design效應(yīng)面法在制劑處方優(yōu)化中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，（23）： 34～37.

[4]余小翠，劉高峰.響應(yīng)面分析法在中藥提取和制備工藝中的應(yīng)用[J].中藥材， 2010，（10）： 1651～1655.

[5]楊文雄，高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食品添加劑， 2005，（02）： 68～71.

[6]田泱源，李瑞芳.響應(yīng)面法在生物過程優(yōu)化中的應(yīng)用[J].食品工程， 2010，（02）： 8～11，53.

[7]王鵬亭，趙宗杰，周榮靈等.3，5二硝基水楊酸法測定樟芝中多糖的含量[J].食品研究與開發(fā)，2016，（09）： 163～167.

[8]李莉，張賽，何強(qiáng)等.響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索， 2015，（08）： 41～45.

[9]聶小偉，何粉霞，陳志兵等.響應(yīng)面優(yōu)化海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2017，（23）： 44～49，99.