葉 飛 ，吳曉冰 ，3，姜 毅 ，吳勝軍 ，王 雨 *

（1.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714；2.中國科學(xué)院 水庫水環(huán)境重點實驗室，重慶 400714；3.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

Woese和Fox在20世紀80年代提出了由古菌、細菌和真核生物組成的三域系統(tǒng)[1]。古菌是地球生物圈中一類豐富且多樣的微生物，廣泛地分布于地球的各類環(huán)境中[2-5]。據(jù)估算，土壤中古菌數(shù)量占所有微生物的比例高達12%～38%[6]。數(shù)量龐大的古菌在生物地球化學(xué)過程中起著十分重要的作用。在碳循環(huán)中，產(chǎn)甲烷古菌產(chǎn)生的甲烷占全球甲烷排放量的70%[7]。除此之外，古菌還積極參與硫循環(huán)，能將二硫化碳（CS2）快速轉(zhuǎn)化為硫化氫（H2S）和CO2[8]。進行化能自養(yǎng)的氨氧化古菌（AOA）能將NH3氧化為NO2-[9]。AOA的發(fā)現(xiàn)徹底改變了氨氧化過程由細菌驅(qū)動的認識，它們在自然界中的龐大數(shù)量意味著其在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化，尤其是全球碳氮循環(huán)方面扮演重要角色[3，7]。

古菌群落的分布受到沿生態(tài)梯度性的生物和非生物因素的影響[10，11]。許多環(huán)境因子都可以影響古菌群落，如海拔[12]、鹽度[13]、氧化還原電位[14]以及pH[15]。土壤水分含量被認為是比區(qū)域或季節(jié)性變化、生境差異等因素對古菌群落影響更大的環(huán)境因子[16]。因此，消落帶水位波動可能會極大地影響其古菌群落的分布[17]。

為滿足發(fā)電、排沙和防洪的需求，三峽水庫采取“蓄清排渾”的運行方案，周期性的水位漲落，在三峽庫區(qū)周邊形成了漲落幅度高達30 m的消落帶，其總面積達到349 km2，為中國面積最大的水庫消落帶[18]。三峽庫區(qū)消落帶水位漲落幅度大，水位漲落與自然洪枯規(guī)律相反。古菌有可能在消落帶碳氮循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用，但是對于三峽消落帶中古菌群落沿高程的分布特征還鮮有報道。本文以不同時間不同高程的消落帶土壤為研究對象，通過高通量測序數(shù)據(jù)分析消落帶古菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)沿高程的分布特征。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)與樣品的采集

白家溪消落帶研究區(qū)位于重慶市開州區(qū)澎溪河濕地市級自然保護區(qū)（31°09′02″N，108°3′45″E，圖1）。該區(qū)域?qū)儆谥衼啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年平均氣溫18.5℃，四季分明，年均降雨量大約1 200 mm，雨季長、雨日多、降水豐富。土壤類型以發(fā)育自紫色砂巖的紫色土為主。

圖1 研究區(qū)和采樣點示意圖Fig.1 The maps of the study region and sampling sites

為調(diào)查不同高程古菌的群落分布特征，分別在消落帶水位上升初期的2013年10月10日和2014年9月23日，以及水位下降末期的2014年4月1日和2015年5月6日共進行2年4次土壤樣品的采集。以海拔150 m為最低點，沿消落帶150～175 m海拔高程選擇一個垂直樣帶，每隔5 m設(shè)置采樣點。每個采樣點采集3個子樣品充分混合成1個混合樣，共形成24個混合樣。樣品采集后放置于無菌密封袋，于冰盒中保存運輸至實驗室。其中1份立即進行理化指標分析，另1份于-20℃儲存，用于DNA提取和后續(xù)分子生物學(xué)實驗。

1.2 土壤性質(zhì)分析

土壤pH采用pH計（FE20，Mettler Toledo，USA）測定，水土比為1∶5。含水率用烘干稱重法測定。土壤NH4+和NO3-的含量用2 mol/L KCl浸提后采用連續(xù)流動注射分析儀（FIA Star 5000，F(xiàn)OSS Tecator，Sweden）測定浸提液得到。土壤有機質(zhì)（OM）采用燒失量法測定?？偺迹═C）、總氮（TN）和總硫（TS）用元素分析儀（Vario EL cube，Elementar，Germany） 測定[19]。

1.3 DNA提取與Illumina高通量測序

土壤樣品采用Power Soil?DNA Isolation Kit（Mobio，USA）試劑盒提取樣品中的總DNA。用超微量紫外分光光度計NanoVue Plus Spectrophotome?ter（GE Healthcare，UK）確定DNA濃度。用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的質(zhì)量。提取的DNA溶液保存于-20℃冰箱中待用。

針對古菌16 S rRNA基因的V3～V5高變區(qū)，使用帶barcode的引物Arch344F（5′-ACGGGGYG?CAGCAGGCGCGA-3′） 和 Arch915R （5′-GT?GCTCCCCCG CCAATTCCT-3′）[20]進行PCR擴增。擴增采用TransGen AP221-02（TransGen，China）的20 μL體系，具體為：5 μL 5 × FastPfu buffer，2 μL dNTPs（脫氧核糖核酸，2.5 mmol/L），0.3 μL FastPfu DNA聚合酶（2.5 U），正、反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，0.2 μL BSA（牛血清白蛋白，20 μg/μL）（TaKaRa，中國大連），DNA模板（10 ng），雙蒸水補足至20 μL。PCR擴增程序為：95 °C預(yù)變性3 min，然后95 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72°C延伸45 s，共32個循環(huán)，最后再72°C延伸10 min。擴增所用的PCR儀為ABI GeneAmp?9700。PCR產(chǎn)物使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN，USA）純化后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega，USA）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合后雙端（PE）測序（2×300）。本研究的Illumina高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（http://www.Majorbio.com）在Illumina Miseq PE300平臺上完成。在1個淹水周期內(nèi)，160 m樣點的淹水和出露時間與165 m樣點非常接近，因此在進行高通量測序及后續(xù)相關(guān)分析過程中將160 m高程采集的樣品排除在外。

1.4 高通量測序序列處理與分析

MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接（merge）成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和拼接的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的bar?code和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，進行數(shù)據(jù)優(yōu)化。

優(yōu)化后的高質(zhì)量序列使用Usearch軟件（vse?sion 7.0，http://drive5.com/uparse/）在97%的相似度下劃分獨立操作單元（OTUs，Operational Taxo?nomic Units）。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)分析，分析比對使用SILVA rRNA數(shù)據(jù)庫（Release 128 http://www.arb-silva.de）。基于得到的OTU數(shù)據(jù)，采用Mothur（version v.1.30.1）計算各個樣品的α多樣性指數(shù)（包括shannon多樣性、Chao1豐富度和shannon均勻度）。為了便于比較各樣品間的差異性，根據(jù)測序樣品中的最小序列數(shù)將所有樣品的序列稀釋到同一測序深度（每個樣品21 068條序列）。

1.5 統(tǒng)計分析

不同高程土壤理化性質(zhì)和古菌群落多樣性差異利用IBM SPSS Statistics 20.0 for Windows的單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較?；贐ray-Curtis距離的主坐標軸分析（Principal Coordi?nates Analysis，PCoA）通過CANOCO 5軟件實現(xiàn)。使用HemI軟件（Heatmap Illustrator，版本1.0）繪制基于平均連接聚類（計算出的兩個聚類之間的距離）和歐幾里德距離（兩組之間計算的距離）的古菌群落結(jié)構(gòu)熱圖。其他圖形繪制使用ORIGIN 9.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 古菌群落α多樣性

基于古菌16 S rRNA基因的Illumina高通量測序數(shù)據(jù)，對不同高程消落帶土壤中古菌群落的α多樣性進行評估，包括Shannon多樣性指數(shù)、Shan?non均勻度指數(shù)和Chao1豐富度指數(shù)。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，消落帶土壤古菌α多樣性3個指標的最大值都出現(xiàn)在150 m高程，而最小值都出現(xiàn)在175 m高程，并且表現(xiàn)出隨著采樣高程的增加而逐漸降低的趨勢。

圖2 不同采樣高程古菌群落α多樣性。箱圖上方的字母不同表示不同高程間的指數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）Fig.2 Alpha-diversity of archaeal communities along the sampling elevations.Different letters above the boxes denote a significant difference between different elevations(P＜0.05)

2.2 古菌群落組成

采用基于Bray-Curtis距離的主坐標軸分析（PCoA），對不同高程消落帶土壤古菌群落結(jié)構(gòu)進行分析（圖3）?？梢园l(fā)現(xiàn)，不同高程樣點表現(xiàn)出從175 m到150 m的梯度性。其中，155 m和150 m高程樣點能很好地聚集在一起，表明這兩個高程土壤中的古菌群落結(jié)構(gòu)較為類似。175 m和170 m高程樣點古菌群落同樣有著較好的聚集性。而165 m高程樣點處于從較高高程到較低高程的過渡區(qū)域，其土壤古菌群落結(jié)構(gòu)與其他高程相比差異較大。

圖3 基于Bray-Curtis距離不同采樣高度的土壤中古菌群落的主坐標軸分析（PCoA）Fig.3 Principal coordinate analysis(PCoA)based on Bray-Curtis distance for aracaeal communities in soils along the sampling elevations

從門水平上可以看出，奇古菌門（Thaumar chaeota）和廣古菌門（Euryarchaeota）是消落帶土壤古菌兩個優(yōu)勢門（圖4）。隨著采樣高程的升高，奇古菌門的相對豐度表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。在175 m、170 m和165 m三個高程土壤中奇古菌門的相對豐度均超過50%，分別為95.6%，83.5%和71.5%，是優(yōu)勢門。而廣古菌門是155 m和150 m高程土壤的優(yōu)勢門，其相對豐度分別為68.0%和55.6%。其他的古菌門，如深古菌門（Bathyarchaeota）、烏斯古菌門（WoesearchaeotaDHVEG-6）在各高程樣點中的相對豐度都較少，但總體表現(xiàn)出隨著采樣高程的降低而增加的趨勢。

圖4 不同高程主要古菌門的相對豐度（相對豐度大于1%）Fig.4 Relative abundances of the dominant archaeal phyla in different sampling elevations （relative abundance＞1%）

本研究還從屬水平上對消落帶土壤中的古菌群落結(jié)構(gòu)進行了分析（圖5）。總共有61個屬水平的古菌物種在消落帶土壤中被發(fā)現(xiàn)，并對相對豐度前20的古菌物種在各高程土壤中的變化情況進行分析。隸屬于奇古菌門的Soil Crenarchaeotic Group（SCG）是消落帶175 m，170 m和165 m高程樣點的優(yōu)勢屬，其相對豐度分別為83.7%、63.4%和48.5%。在SCG為優(yōu)勢屬的高程樣點中，同樣隸屬于奇古菌門的Candidatus Nitrososphaera占有較大比例，達到10.4%～23.0%，且從175 m到165 m高程逐漸升高。然而，在較低高程的155 m和150 m樣點，Candidatus Nitrososphaera的相對豐度分別只有2.9%和6.4%。消落帶155 m高程相對豐度前3的古菌物種分別為Methanosarcina（24.3%），SCG（20.2%） 和ThermoplasmatalesIncertae Sedis（11.0%），而150 m高程相對豐度前三的古菌物種分別為SCG（26.3%），Methanosarcina（14.3%）和Methanosaeta（12.9%），在155 m和150 m高程沒有發(fā)現(xiàn)明顯的優(yōu)勢物種。

圖5 相對豐度前二十的古菌物種在不同高程的相對豐度（主要為屬水平）Fig.5 Relative abundances of the 20 most dominant archaeal taxa(primarily at genus level)in different sampling elevations

2.3 古菌群落的環(huán)境影響因子

從土壤性質(zhì)與主要古菌物種的相關(guān)性熱圖（圖6）可以看出，消落帶土壤中SCG與NH4+（P＜0.001）、含水率（P＜0.01）和pH（P＜0.05）顯著負相關(guān)，Candidatus Nitrososphaera同樣與NH4+（P＜0.05）和含水率（P＜0.05）顯著負相關(guān)。而大多數(shù)的產(chǎn)甲烷古菌，如Methanosarcina（P值分別為0.01和0.01）和Methanosaeta（P值分別為0.01和0.001）都和土壤中NH4+和含水率顯著正相關(guān)。消落帶土壤NO3-含量主要與古菌物種表現(xiàn)出負相關(guān)，如Methano?sarcina，Marine Benthic Group和Metheanoregula等（P＜0.05）。然而消落帶土壤中的OM，TC，TN和TS沒有與任何古菌物種呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性（圖6）。

3 討論

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，諸如淹水等環(huán)境條件的變化是影響生物群落組成的常見干擾。本文應(yīng)用高通量測序的方法分析了三峽庫區(qū)消落帶土壤古菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)沿高程梯度的空間變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)古菌群落α多樣性表現(xiàn)出隨著采樣高程降低而升高的趨勢。這可能是因為較低高程土壤受到的淹水干擾在古菌群落適宜的范圍內(nèi)，“中度干擾”理論表明一定程度的干擾能導(dǎo)致生物群落的多樣性增加[21-22]。此外，土壤水份發(fā)揮著傳輸營養(yǎng)物質(zhì)的作用，淹水能導(dǎo)致大量的營養(yǎng)物質(zhì)進入土壤孔隙中，而豐富的土壤營養(yǎng)往往與高的微生物多樣性聯(lián)系在一起。因此，消落帶低高程樣點長時間的淹水能為土壤攜帶大量的營養(yǎng)物質(zhì)，可能促進古菌群落多樣性的增加。

消落帶古菌群落組成的變化與高程密切相關(guān)。奇古菌門是較高高程樣點的優(yōu)勢古菌門（相對豐度為71.5%～95.6%）。這與多數(shù)研究表明土壤中有著相當數(shù)量的奇古菌門[4]是一致的。隸屬于奇古菌門的SCG是175 m、170 m和165 m高程土壤中的優(yōu)勢古菌物種，表明在此高程區(qū)間古菌發(fā)揮著重要的氨氧化作用。此外，Candidatus Nitrososphaera組在較高高程占有較大比例，但是在155 m和150 m高程的相對豐度很?。ǚ謩e為2.9%和6.4%）。這可能跟淹水導(dǎo)致不同高程土壤的氧環(huán)境存在較大差異有關(guān)。奇古菌門主要由好氧氨氧化古菌組成，較高高程土壤淹水時間較短，有著較好的氧環(huán)境，適宜好氧氨氧化古菌的生長。

不同于奇古菌，廣古菌更多存在于淹水時間較長的低高程樣點中。絕大多數(shù)的廣古菌門（如產(chǎn)甲烷菌）都是嚴格厭氧微生物，與土壤含水量顯著正相關(guān)。穩(wěn)定的氧化還原條件更有利于廣古菌門微生物的生長[23]，消落帶低高程相對穩(wěn)定的厭氧環(huán)境更適合廣古菌。廣古菌門的產(chǎn)甲烷菌，包括Methanosarcina和Methanosaeta，大量存在于低高程樣點中，但在高海拔樣點中急劇減少。產(chǎn)甲烷菌沿高程梯度的分布與它們嚴格的厭氧代謝機理是一致的。淹水是土壤形成厭氧環(huán)境最直接的方法，這解釋了產(chǎn)甲烷菌大量存在于頻繁且長時間淹水土壤的原因[16]。產(chǎn)甲烷古菌和氨氧化古菌的分布與土壤含水率密切相關(guān)，表現(xiàn)出沿高程梯度完全相反的分布特征，這在一定程度上反映了古菌群落在消落帶土壤碳氮循環(huán)過程中的功能存在空間分異。