李曉春 王莉芳 鄭 旭 徐長(zhǎng)根

陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710065

自2014年6月1日起開(kāi)始施行的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》中明確提出國(guó)家對(duì)醫(yī)療器械按照風(fēng)險(xiǎn)程度實(shí)行分類管理。 根據(jù)2017年8月頒布的醫(yī)療器械分類目錄[1]，陰道黏膜修復(fù)敷料屬于無(wú)源植入器械中的組織工程支架材料，屬Ⅲ類器械，即屬具較高風(fēng)險(xiǎn)，需采取特別措施嚴(yán)格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械[2]。我們按照GB/T系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)陰道黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了細(xì)胞毒性、遲發(fā)型過(guò)敏及刺激等生物學(xué)評(píng)價(jià)，給出其應(yīng)用于臨床的可行性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試品

三個(gè)廠家提供的供試品，分別記為1#、2#、3#，均為殼聚糖類修復(fù)敷料。

1.2 材料、藥品、試劑

高密度聚乙烯：批號(hào)：K0M357，美國(guó)藥典委員會(huì)；氯化鈉注射液，批號(hào)：160130 3G，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清，貨號(hào)：TBD21HY，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；RPMI培養(yǎng)基，批號(hào)：AB10125297，HyClone；青鏈霉素混合液（100×），批號(hào)：20170503，Solarbio；胰蛋白酶，批號(hào)：SLBP8607V，Sigma；二甲基亞砜（DMSO），批號(hào)：20140305，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；噻唑藍(lán)（MTT），批號(hào)：MKBN7264V，Sigma。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物

細(xì)胞株，L929細(xì)胞，武漢博士德生物工程有限公司。

白化豚鼠、雌性白化新西蘭兔，由西安市迪樂(lè)普生物資源開(kāi)發(fā)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2014-001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（陜）2013-001。

1.4 儀器

電子天平，BS2202S，賽多利斯儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，BSP-250，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低速臺(tái)式離心機(jī)，KA-1000，上海安亭科學(xué)儀器廠；醫(yī)用凈化工作臺(tái)，SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，HF151，上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡，XSZ-D2，重慶光學(xué)儀器廠；酶標(biāo)儀，Versa Max0310-3264，美國(guó)分子儀器有限公司。

2 方法

2.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗(yàn)[4-6]

健康白化豚鼠共35只，雌雄不限。30只作為試驗(yàn)組，每個(gè)樣品10只，5只作為對(duì)照組。試驗(yàn)前剔除豚鼠背部被毛。

（1）誘導(dǎo)階段

用吸收性紗布浸透供試品1mL，局部貼敷于每只動(dòng)物的左上背部位。6h后除去包扎帶和紗布。1周中連續(xù)3d重復(fù)該步驟，同法操作3周。對(duì)照組以氯化鈉注射液同法操作。

（2）激發(fā)階段

最后一次誘導(dǎo)貼敷后14d，用供試品和氯化鈉注射液對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行激發(fā)。方法同（1），貼敷于每只動(dòng)物去毛的未試部位。6h后除去包扎帶和紗布。

（3）動(dòng)物觀察

激發(fā)后24h剃去激發(fā)部位及其周圍的被毛，溫水洗凈擦干，按表1對(duì)試驗(yàn)部位評(píng)分，并于48h再次評(píng)分。

表1 Magnusson和Kligman分級(jí)

2.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法）[3，7-9]

（1）試驗(yàn)樣品及試液的制備

供試液：無(wú)菌條件下將陰道黏膜修復(fù)敷料與含血清培養(yǎng)基按0.2g/mL的比例于37℃浸提24h后2000rpm離心5min，取上清。

陰性對(duì)照液：取高密度聚乙烯（厚度為1mm）36cm2，剪成5mm×25mm的小塊，加12mL細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，37℃浸提24h，過(guò)濾除菌。

陽(yáng)性對(duì)照液：5%的DMSO溶液，過(guò)濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

空白對(duì)照液：同細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液。

（2）方法：將細(xì)胞制成密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液并接種于96孔板，設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和供試品組，每組各設(shè)至少6孔，每孔接種100μL。置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。各組加入每孔100μL的相應(yīng)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，加入150μL的DMSO，酶標(biāo)儀570nm和630nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算相對(duì)增值率（RGR）[10]。

RGR=A/A0×100%，式中：

RGR——相對(duì)增值率，%；

A——供試品組（陽(yáng)性及陰性對(duì)照組）吸光度；

A0——空白對(duì)照組吸光度。

根據(jù)RGR按表2分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定。陰性對(duì)照組的反應(yīng)應(yīng)不大于1級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組至少為3級(jí)反應(yīng)。

表2 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

2.3 黏膜刺激試驗(yàn)[4，11-12]

選取陰道無(wú)明顯刺激癥狀、無(wú)缺陷和無(wú)損傷的健康雌性家兔12只，體重不低于2kg，供試品組及對(duì)照組各3只。供試品組家兔陰道注入1mL供試品，對(duì)照組注入等量的氯化鈉注射液。每次間隔24h連續(xù)重復(fù)上述步驟，至少連續(xù)5d。末次接觸后24h，無(wú)痛處死動(dòng)物，完整切下陰道后縱向切開(kāi)，檢查黏膜組織的刺激、損傷及壞死情況。常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，LEICA生物顯微鏡觀察。按表3規(guī)定的記分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分。試驗(yàn)組動(dòng)物顯微鏡評(píng)價(jià)記分相加后再除以觀察總數(shù)即得試驗(yàn)組平均記分，對(duì)照組同法計(jì)算。試驗(yàn)組平均記分減去對(duì)照組平均記分即得出刺激指數(shù)，見(jiàn)表4。

3 結(jié)果

3.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

供試品組及對(duì)照組中豚鼠的反應(yīng)等級(jí)均為0，在本試驗(yàn)條件下，均未觀察到三批陰道黏膜修復(fù)敷料導(dǎo)致豚鼠出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)跡象，結(jié)果見(jiàn)表5。

3.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級(jí)別為3級(jí)，陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級(jí)別為0級(jí)，試驗(yàn)系統(tǒng)成立。三批陰道黏膜修復(fù)敷料的細(xì)胞毒性反應(yīng)級(jí)別均不大于2級(jí)，在標(biāo)準(zhǔn)可接受范圍內(nèi)[8]。顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表6。

表3 口腔、陰莖、直腸和陰道組織反應(yīng)顯微鏡計(jì)分系統(tǒng)

表4 刺激指數(shù)

表5 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

表6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)

3.3 黏膜刺激性試驗(yàn)結(jié)果

病理檢查結(jié)果顯示：對(duì)照組的黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見(jiàn)極少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)血管充血及極輕度水腫。試驗(yàn)組的黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見(jiàn)極少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度血管充血及極輕度水腫。結(jié)果表明，三批陰道黏膜修復(fù)敷料均具極輕度黏膜刺激，病理切片見(jiàn)圖2，計(jì)分結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 陰道黏膜刺激性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 各組病理切片圖

4 討論

陰道黏膜修復(fù)敷料的主要成分為殼聚糖，是一種天然的堿性高分子化合物，具有良好的生物相容性、可降解性、吸附性、成膜性[13]，能激活陰道內(nèi)多種免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性[14]，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)得到恢復(fù)和加強(qiáng)，并能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮多種生理活性，誘導(dǎo)并提高細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性，改善陰道內(nèi)的生態(tài)環(huán)境。具優(yōu)良的抑菌作用，對(duì)許多微生物包括細(xì)菌和真菌，都有不同程度的抑制作用。同時(shí)陰道黏膜修復(fù)敷料還有促進(jìn)陰道內(nèi)表皮細(xì)胞血液凝固的作用，可用作止血?jiǎng)３謩?chuàng)面濕潤(rùn)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[15]，對(duì)陰道黏膜的創(chuàng)口、感染、出血等癥狀產(chǎn)生積極的作用。目前，不少生物技術(shù)公司自主研發(fā)的陰道黏膜修復(fù)敷料進(jìn)入了上市前評(píng)價(jià)階段，但由于生產(chǎn)工藝的改進(jìn)過(guò)程中涉及到生物材料的修飾改性工藝，故急需對(duì)其應(yīng)用于人體的生物安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]。本文按照GB/T16886及GB/T14233的系列標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三批陰道黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了生物安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示無(wú)豚鼠皮膚致敏反應(yīng)，對(duì)家兔陰道黏膜具極輕度刺激，細(xì)胞毒性不大于2級(jí)，均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的可接受范圍內(nèi)。初步認(rèn)為三批陰道黏膜修復(fù)敷料毒性較低，有望用于臨床。