鹿連明 蒲占湑 胡秀榮 杜丹超 黃振東 陳國(guó)慶

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州318026）

目前對(duì)柑橘綠霉病的防治主要以化學(xué)藥劑為主，如咪唑類殺菌劑咪鮮胺和抑霉唑、雙胍鹽類殺菌劑百可得等?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用除帶來(lái)環(huán)境污染、食品安全等問(wèn)題外，還易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性。研究表明柑橘綠霉病菌已對(duì)咪鮮胺等殺菌劑產(chǎn)生了普遍的抗藥性[1]，其對(duì)柑橘綠霉病防治效果下降甚至失效的情況時(shí)有發(fā)生[2]。因此，篩選并使用新型柑橘防腐殺菌劑，對(duì)于柑橘的安全生產(chǎn)具有重要意義。微生物農(nóng)藥以其高效低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)越來(lái)越受到重視。目前已報(bào)道的對(duì)柑橘采后病原真菌具拮抗活性的微生物多以細(xì)菌和酵母菌為主，少數(shù)為陸地放線菌[3]，而利用海洋放線菌防治柑橘綠霉病方面的研究相對(duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)室從浙江省玉環(huán)市海山潮間帶采集的鱗笠藤壺中分離獲得一株海洋放線菌，通過(guò)平板對(duì)峙法測(cè)定得知該菌株對(duì)柑橘綠霉病菌、柑橘炭疽病菌等多種植物病原菌均有較強(qiáng)的拮抗活性[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步測(cè)定了該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病菌的抑制活性，以期為將來(lái)開(kāi)發(fā)相關(guān)的微生物藥劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試海洋放線菌菌株A3202為本實(shí)驗(yàn)室從浙江省玉環(huán)市海山潮間帶采集的鱗笠藤壺中分離獲得；供試柑橘綠霉病菌為本實(shí)驗(yàn)室從柑橘果實(shí)中分離獲得。

1.2 供試培養(yǎng)基

用于海洋放線菌菌株A3202活化的培養(yǎng)基為高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基，購(gòu)自山東拓普生物工程有限公司；用于菌株A3202發(fā)酵用培養(yǎng)基為黃豆粉培養(yǎng)液，配方為：黃豆粉20g、葡萄糖20g、硫酸銨5g、氯化鈉8g、碳酸鈣2g、蒸餾水1000mL；用于柑橘綠霉病菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g、水1000mL。馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基，配方同PDA，不添加瓊脂。

1.3 無(wú)菌發(fā)酵液的制備

以無(wú)菌接種環(huán)挑取高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上保存的菌株A3202，于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基中劃線后，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。之后以無(wú)菌打孔器打取菌株A3202菌餅，接種至高壓滅菌后的黃豆粉培養(yǎng)液中，于28℃恒溫?fù)u床中以轉(zhuǎn)速180rpm/min震蕩培養(yǎng)6d。之后將發(fā)酵產(chǎn)物于臺(tái)式離心機(jī)12000rpm/min離心20min，除去菌絲體收集上清液，再將上清液經(jīng)由無(wú)菌濾膜抽濾除菌，制得菌株A3202的無(wú)菌發(fā)酵液。

1.4 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)定

將制得的無(wú)菌發(fā)酵液與融化的PDA培養(yǎng)基混勻，然后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成帶藥平板。以加純培養(yǎng)基的PDA平板為對(duì)照。以無(wú)菌打孔器在預(yù)先培養(yǎng)的柑橘綠霉病菌菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅，將菌餅置于帶藥平板中央，于28℃微生物培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用下述公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.5 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性測(cè)定

刮取PDA 平板上的柑橘綠霉病菌，制得分生孢子懸浮液。加入適量菌株A3202的無(wú)菌發(fā)酵液并充分混勻，以不加粗提物的孢子懸浮液為對(duì)照。將其滴加到含有PDB培養(yǎng)基的無(wú)菌載玻片的中央，然后將玻片放于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中的U型管上，以無(wú)菌水濕潤(rùn)濾紙，并置于28℃微生物培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，以上各處理均重復(fù)3次。培養(yǎng)一定時(shí)間后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)400～600個(gè)孢子，以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子長(zhǎng)度1/2為標(biāo)準(zhǔn)視為孢子萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.6 對(duì)柑橘綠霉病的防效測(cè)定

將供試柑橘果實(shí)在無(wú)菌發(fā)酵液中浸泡后取出晾干，以無(wú)菌水浸泡處理的果實(shí)作為陰性對(duì)照，以咪鮮胺浸泡處理的果實(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照。將各處理的果實(shí)涂抹濃度為1×106個(gè)孢子/mL 的柑橘綠霉病菌孢子懸浮液。然后將處理過(guò)的果實(shí)放于保鮮盒中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)柑橘果實(shí)發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)病；1級(jí)：病斑占果表面積5%以下；3級(jí)：6%～10%；5級(jí)：11%～25%；7級(jí)：26%～50%；9級(jí)：51%以上。病情指數(shù)=Σ（各級(jí)爛果數(shù)×該級(jí)代表值）/（總數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；相對(duì)防效=（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

從試驗(yàn)結(jié)果（如圖1）得知，在添加有菌株A3202無(wú)菌發(fā)酵液的PDA平板上，柑橘綠霉病菌的生長(zhǎng)速度較慢，明顯低于未添加無(wú)菌發(fā)酵液的PDA平板，且菌落上易形成皺褶，難以向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)。測(cè)定菌株A3202無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率可達(dá)66.82%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制柑橘綠霉菌菌絲生長(zhǎng)的活性。

2.2 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性

從試驗(yàn)結(jié)果（如圖2）得知，菌株A3202無(wú)菌發(fā)酵液會(huì)明顯抑制柑橘綠霉菌的分生孢子萌發(fā)。培養(yǎng)6h后，在添加有菌株A3202無(wú)菌發(fā)酵液的PDB培養(yǎng)基中，柑橘綠霉菌的分生孢子萌發(fā)率僅為26.32%，且芽管較短，很少見(jiàn)到生長(zhǎng)成的菌絲；而在未添加無(wú)菌發(fā)酵液的PDB 培養(yǎng)基對(duì)照中，其分生孢子萌發(fā)率可高達(dá)75.63%，且有很多芽管繼續(xù)生長(zhǎng)成較長(zhǎng)的菌絲。

2.3 對(duì)柑橘綠霉病的防效

從測(cè)定結(jié)果（表1）可知，菌株A3202無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病表現(xiàn)出一定的防效。在柑橘綠霉菌接種后培養(yǎng)10d，以無(wú)菌發(fā)酵液處理后的柑橘果實(shí)的病情指數(shù)為4.23，而未用無(wú)菌發(fā)酵液處理的對(duì)照的病情指數(shù)則為15.85，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病的相對(duì)防效可高達(dá)73.41%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的柑橘果實(shí)綠霉病的發(fā)病情況明顯加重，在接種后20d，以無(wú)菌發(fā)酵液處理后的柑橘果實(shí)的病情指數(shù)增長(zhǎng)為26.37，而未用無(wú)菌發(fā)酵液處理的對(duì)照的病情指數(shù)則升高為50.23，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病的防效下降為47.20%，低于400mg/L的咪鮮胺的防效。

海洋放線菌菌株A3202

無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉病的防效

表1

3 討論

在利用海洋放線菌防治植物病害方面，人們開(kāi)展了諸多有益的探索。如馬桂珍等從海水、海泥和海洋動(dòng)植物樣品中篩選出一株對(duì)番茄早疫病菌等植物病原真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有抑制作用的海洋放線菌[5]；蒲小明等從多個(gè)海洋放線菌菌株中篩選出一株對(duì)花生青枯病菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，并鑒定其活性成分為放線菌素V[6]；方麗萍從海水、海泥樣品中篩選出3株海洋放線菌，其發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、蘋果輪紋病菌等多種植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用[7]。

菌株A3202為本實(shí)驗(yàn)室從海山潮間帶采集的鱗笠藤壺中分離獲得的一株海洋放線菌，測(cè)定得知其對(duì)多種植物病原菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。本研究測(cè)定了其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)柑橘綠霉菌的抑菌活性，從研究結(jié)果可知，其對(duì)柑橘綠霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用，對(duì)柑橘綠霉病也表現(xiàn)出一定的防效，表現(xiàn)出較好的開(kāi)發(fā)利用前景。因此，在此基礎(chǔ)上，有必要通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件、誘變改良等手段提高菌株A3202的抑菌活性，分離提取其主要活性成分并測(cè)定其抑菌效果，進(jìn)一步探索其在柑橘病害生物防治中的應(yīng)用價(jià)值。