周冉冉,高虹,范秀芝,殷朝敏,陳浙婭,姚芬,史德芳,3
(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,湖北武漢 430064)(2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430064)(3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)
香菇(Lentinus edodes),屬于真菌中的一種可食用菌,是世界第二大食用菌[1]。鮮香菇富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和一般蔬菜不含有的麥角甾醇,其中蛋白質(zhì)由18種氨基酸組成,并含有8種人體必需的氨基酸[2]。此外,其含有的香菇多糖具有多種生物活性,是目前已知的最強(qiáng)免疫增強(qiáng)劑之一[3]。香菇還具有降血脂和抗腫瘤的作用[4~6]。
隨著消費(fèi)者對(duì)天然健康理念的認(rèn)同和追求,目前,其消費(fèi)模式已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)變,逐漸由干香菇向鮮香菇轉(zhuǎn)變。鮮香菇含90%左右的水分,其含水量極高,不同與農(nóng)產(chǎn)品的不同,由于沒有外皮保護(hù),容易在采摘和運(yùn)輸過程中容易受到機(jī)械損傷,采后菇體的呼吸作用及蒸騰作用旺盛,極易發(fā)生失水萎焉、皺縮、褐變和腐爛等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[7],因此,如何保持鮮香菇的食用品質(zhì),延長貨架期是業(yè)界亟需解決的問題之一[8]。針對(duì)鮮香菇的這種特性,探究一種方便有效的保鮮方法十分必要。
目前鮮香菇的保鮮方法有低溫貯藏[9]、氣調(diào)包裝[10],涂膜保鮮[11]和輻照[12]等。食品輻照處理是一種非熱型加工保鮮新技術(shù),具有抑制發(fā)芽、推遲成熟、殺蟲、滅菌和延長貨架期等作用,廣泛運(yùn)用于果蔬的加工、貯藏保鮮[13]。目前運(yùn)用到的輻照包括鈷-60、銫-137產(chǎn)生的γ射線和電子加速器產(chǎn)生的低于100 MeV電子束射線。60Coγ射線輻照是一種物理保鮮方式,和傳統(tǒng)的熱加工殺菌方式相比,是一種冷殺菌方式[14,15]。食用菌在采后仍然有較強(qiáng)的生命活動(dòng),酶活是生命活動(dòng)中最重要的活動(dòng),也是影響果蔬類食品保鮮效果的關(guān)鍵因素之一[16]。本文采用60Co-γ射線輻照處理鮮香菇,通過不同輻照劑量處理后在4±1 ℃、濕度為80±5%的環(huán)境下進(jìn)行貯藏試驗(yàn),通過考察60Coγ的滅菌效果和對(duì)香菇硬度、色澤、相關(guān)酶活性的影響,確定出最佳輻照劑量,為鮮香菇輻照保鮮提供科學(xué)依據(jù)。
新鮮香菇,購于三友(隨州)食品有限公司。挑選大小均一,外觀一致,未開傘無機(jī)械損傷的新鮮香菇,將其分為4組,每組6袋,每袋10個(gè)。4組香菇分別做以下處理:(1)不做任何處理,作為對(duì)照組(CK);(2)1 kGy60Coγ射線輻照;(3)1.5 kGy60Coγ射線輻照;(4)2 kGy60Coγ射線輻照。處理結(jié)束后放置4±1 ℃,濕度80±5%的環(huán)境中貯藏,分別在貯藏第0、4、8、12、16、20 d進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。
磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉,聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP),蛋氨酸(MET),核黃素,EDTA二鈉,EDTA,硼酸,硼砂,平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氮藍(lán)四唑(NBT),Sigma;二硫蘇糖醇(DTT),L-苯丙氨酸,上海麥克林生物化學(xué)有限公司;氧化型谷胱甘肽(GSSG),NADPH四鈉鹽,Biofroxx;β-疏基乙醇,西亞試劑;纖維素酶試劑盒,幾丁質(zhì)酶試劑盒,南京建成生物工程研究所。
TA-Txplus質(zhì)構(gòu)儀,英國SMS公司;UV-1800紫外可見分光光度計(jì),島津;H1650R型醫(yī)用離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;伽馬射線輻照源,60Co源(裝源量25.5萬居里),湖北省輻照實(shí)驗(yàn)中心。
1.3.1 微生物含量的測(cè)定
參照J(rèn)iang T等[17]的方法稍作改動(dòng)。用平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)培養(yǎng)嗜溫菌,培養(yǎng)條件為2 d,溫度為35±1 ℃;用PDA培養(yǎng)霉菌、酵母,培養(yǎng)條件為:5~7 d,溫度為 28±1 ℃。
1.3.2 硬度的測(cè)定
參照李志嘯等[18]的方法稍作改動(dòng)。使用TA-Txplus質(zhì)構(gòu)儀對(duì)香菇進(jìn)行硬度測(cè)定,選用 P/36R探頭。將香菇放置在操作臺(tái)上,探頭以5 mm/s的速度進(jìn)行下壓,用最大力的峰值表示硬度。
1.3.3 色澤的測(cè)定
參照J(rèn)iang T[19]等的方法稍作改動(dòng)。用CR-400色彩色差計(jì)對(duì)香菇的色澤(L*、a*、b*)進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)香菇蓋縱切面正中點(diǎn),平行測(cè)定三次。L*表示白色,L*值越小表示越黑:a*表示紅綠,值“+”為紅,“-”為綠;b*表示黃藍(lán),值“+”為黃,“-”藍(lán),每個(gè)香菇理想的顏色值是L0=97,a0=-2,b0=0。ΔE值表示與理想顏色值相比,香菇色澤變化的程度,用測(cè)得的L*、a*、b*計(jì)算ΔE值和褐變指數(shù)(BI),公式如下:
1.3.4 超氧化物歧化酶活性測(cè)定
參照曹建康[20]等的方法進(jìn)行測(cè)定,取1 g樣品,加入3 mL提取緩沖液冰浴研磨,離心取上清。向試管中加入反應(yīng)液及酶液。2支空白管加入提取緩沖液代替酶液。試管混勻后,將其中一支空白管放置于暗處,其余試管置于4000 lx日光燈下反映15 min后立即置于暗處終止反應(yīng),并于560 nm處測(cè)定吸光值。不照光照空白管做空白調(diào)零,SOD活性(U/g組織)計(jì)算公式如下:
其中:A0-照光空白管測(cè)定吸光度值;As-樣品管測(cè)定吸光度值;V-樣品提取液總體積;M-樣品的質(zhì)量。
1.3.5 谷胱甘肽還原酶活性測(cè)定
參照曹建康等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定,取1 g樣品,加入5 mL提取緩沖液冰浴研磨,離心取上清液酶液。向試管中加入反應(yīng)液和0.2 mL酶液。再加入40 μL 4 mmol/L NADPH溶液后立即混合計(jì)時(shí),30 s后在340 nm處開始測(cè)定吸光度A1,每隔30 s測(cè)定一次,連續(xù)測(cè)定6次(A1~A6)。用蒸餾水進(jìn)行空白調(diào)零,GR活性(U/g組織)計(jì)算公式如下:
其中:A1-反應(yīng)混合液吸光度初始值;A6-反應(yīng)混合液吸光度終止值;V-樣品提取液總體積;M-樣品的質(zhì)量。
1.3.6 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定
參照曹建康等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定,取1 g樣品,加入5 mL提取緩沖液冰浴研磨,離心取上清液酶液低溫保存。向試管中加入3反應(yīng)液,放入37 ℃保溫10 min后加入0.5 mL酶液迅速混合并測(cè)定混合液在290 nm下的吸光值A(chǔ)0。將試管再放入37 ℃保溫60 min后,立即測(cè)定此時(shí)吸光值A(chǔ)1。蒸餾水作為空白調(diào)零,PAL活性(U/g組織)計(jì)算公式如下:
其中:V-樣品提取液總體積;M-樣品的質(zhì)量。
1.3.7 纖維素酶活性測(cè)定
采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定。按照纖維素酶試劑盒說明書進(jìn)行操作,于 550 nm下測(cè)定樣品吸光度值。CL活性(U/g組織)計(jì)算公式如下:
其中:A1-樣品管測(cè)定吸光度值;Ac-對(duì)照管測(cè)定吸光度值;As-標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定吸光度值;A0-空白管測(cè)定吸光度值;V-樣品提取液總體積;M-樣品的質(zhì)量。
1.3.8 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定
采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定。取1 g樣品加入3 mL提取緩沖液在冰浴研磨均漿后,離心,取上清酶液待測(cè)。
按照幾丁質(zhì)酶試劑盒說明書進(jìn)行操作,于585 nm下測(cè)定樣品吸光度值。幾丁質(zhì)酶活性(U/g組織)計(jì)算公式如下:
其中:A-樣品測(cè)定吸光度值;M-樣品的質(zhì)量。
每組樣品平行測(cè)定三次,數(shù)據(jù)用x±s來表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANONA顯著性分析,其中p<0.05代表差異顯著,所有圖表采用Origin 8.0進(jìn)行繪制。
不同輻照處理的香菇中含有嗜溫菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果如表1和表2所示,經(jīng)過不同劑量輻照之后,香菇所含有的嗜溫菌、霉菌和酵母菌數(shù)量顯著減小,而且在貯藏期間,輻照組的嗜溫菌、霉菌和酵母菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(p<0.05),由此可見,輻照能顯著抑制微生物的生長。這與Jiang T[17]研究結(jié)論是一致的,即輻照能抑制微生物生長,但輻照劑量不同,抑菌效果也不同。
表1 不同輻照處理對(duì)嗜溫菌數(shù)量的影響Table 1 Effect of different irradiation treatments on mesophilic bacteria
表2 不同輻照處理對(duì)霉菌和酵母菌數(shù)量的影響Table 2 Effects of different irradiation treatments on the number of Fungi and Yeast
消費(fèi)者判斷香菇品質(zhì)的重要指標(biāo)之一是香菇的硬度[17],香菇硬度下降是其品質(zhì)劣變的原因之一。
圖1 不同輻照劑量對(duì)香菇硬度的影響Fig.1 Effect of different irradiation treatments on the hardness of Lentinus edodes
如圖1所示,隨著貯藏時(shí)間的延長,香菇硬度呈下降趨勢(shì)。香菇硬度的下降,可能是采后由于細(xì)菌對(duì)細(xì)胞壁的降解以及內(nèi)源性自溶素的活性增加導(dǎo)致的[21],在第4 d,香菇硬度差異并不顯著(p>0.05),不同輻照劑量組硬度下降趨勢(shì)大致相同;到貯藏第20 d,4組不同處理的硬度下降率分別是62.18%、41.42%、48.07%和59.97%,0 KGy組和2 KGy組下降較1 KGy組和1.5 KGy組快。1 KGy組的硬度較其他組硬度大,其顯著性p<0.05,因此,1 KGy輻照處理的香菇硬度較其他組好。Jiang T[17]等人通過實(shí)驗(yàn)得到1.0 KGy和1.5 KGy結(jié)合氣調(diào)包裝可以保持高水平的香菇質(zhì)地達(dá)到20 d左右。
表3 不同輻照處理對(duì)香菇色澤的影響Table 3 Effect of different irradiation treatments on the color of Lentinus edodes
表4 不同輻照處理對(duì)香菇褐變指數(shù)的影響Table 4 Effect of different irradiation treatments on browning index of Lentinus edodes
香菇在采摘之后,生物體仍在進(jìn)行活躍的代謝活動(dòng),由于貯藏時(shí)間的延長,生物體產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物積累導(dǎo)致褐變,組織褐變是評(píng)價(jià)食用菌品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[22]。香菇組織褐變也有可能歸因于微生物的作用[23]。
由表3和表4可知:到貯藏12 d,香菇色澤差異并不顯著(p>0.05),說明輻照處理對(duì)香菇色澤沒有直接的影響。從貯藏第16 d開始,0 KGy組和1 KGy組香菇變化較 1.5 KGy組和 2 KGy組差異顯著(p<0.05),到貯藏結(jié)束,1 KGy組的ΔE值為11.12±0.42,較其他組的ΔE值小,表明與理想顏色值相比,香菇色澤變化的程度較?。? KGy組的褐變指數(shù)為1.21±0.12,相比于其他組的褐變指數(shù)都小,說明1 KGy組的褐變程度較其他組小。
圖2 不同輻照處理對(duì)香菇SOD活性的影響Fig.2 Effect of different irradiation treatments on SOD activity of Lentinus edodes
圖3 不同輻照處理對(duì)香菇GR活性的影響Fig.3 Effect of different irradiation treatments on GR activity of Lentinus edodes
超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GR)是屬于植物抗氧化系統(tǒng)中的酶的,抗氧化系統(tǒng)在植物的成熟和衰老的過程起著重要作用[11]。
由圖2可知:輻照之后的SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì),到貯藏第4 d,香菇的SOD活性差異顯著(p<0.05),這可能與輻照誘發(fā)自由基的產(chǎn)生有關(guān)[24]。到貯藏第12 d,1 KGy組SOD活性較其他組下降緩慢。由圖3可知:GR活性是呈下降趨勢(shì)的,1 KGy組GR活性降低率為49.09%,而0 KGy、1.5 KGy和2.0 KGy組的分別是84.51%、63.63%和76.36%,由此可知1 KGy組 GR活性較其他組下降緩慢,說明劑量為 1 KGy能延緩其抗氧化能力的降低。
PAL是許多植物酚類物質(zhì)和木質(zhì)素等次生物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶,木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要成分,木質(zhì)素含量在貯藏過程中積累會(huì)引起植物組織質(zhì)地老化,影響食品的食用口感[25,26]。受到輻照后香菇組織的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷代謝被激活,PAL活性迅速上升,提高了組織的抗逆境能力。
圖4 不同輻照處理對(duì)香菇PAL活性的影響Fig.4 Effect of different irradiation treatments on PAL activity of Lentinus edodes
由圖可知:PAL活性整體是呈上升趨勢(shì)的,說明在貯藏過程中木質(zhì)素的含量是逐漸增加的。輻照第 0 d,1 KGy組與1.5 KGy相比差異并不顯著(p>0.05),在之后的貯藏期間,對(duì)照組與輻照組差異顯著(p<0.05),說明輻照對(duì)PAL活性由影響,由圖可知,貯藏8 d后,1 KGy組明顯呈下降趨勢(shì),說明木質(zhì)素的積累是在逐漸降低的;到貯藏結(jié)束0 KGy、1.0 KGy、1.5 KGy和2.0 KGy組的PAL活性整體上升率分別為57.14%、13.33%、40.01%和25.51%,1 KGy組相比于其他組的PAL活性上升較低,組織質(zhì)地老化較輕,因此,1 KGy輻照能較好的抑制其組織質(zhì)地的老化。
圖5 不同輻照處理對(duì)香菇纖維束酶活性的影響Fig.5 Effect of different irradiation treatments on fiber bundle enzyme activity of Lentinus edodes
纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一,在植物細(xì)胞壁中起著重要作用:是衡量細(xì)胞老化的指標(biāo)之一[27,28]。纖維素能在纖維素酶的作用下被水解,有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,香菇貯藏過程中纖維束含量是增加的,香菇中纖維素含量高可能會(huì)影響其質(zhì)地老化[11]。
由圖可知:香菇中纖維素酶活性呈上升趨勢(shì),輻照組與對(duì)照組差異顯著(p<0.05),0 KGy、1.0 KGy、1.5 KGy和 2.0 KGy組的纖維素酶活性分別增加了53.12%、67.39%、60.52%和55.88%,1 KGy組活性較其他輻照組強(qiáng),說明劑量為1 KGy能減少纖維素的積累,較好的保持香菇的質(zhì)地,延遲香菇組織老化。
圖6 不同輻照處理對(duì)香菇幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.6 Effect of different irradiation treatments on chitinase activity of Lentinus edodes
幾丁質(zhì)酶能降解幾丁質(zhì),幾丁質(zhì)是多種真菌細(xì)胞壁的主要成分,因此,植物中廣泛存在幾丁質(zhì)酶能抑制病原菌的生長[20];同時(shí)香菇細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量增多與香菇的韌性呈正相關(guān)[21]。由實(shí)驗(yàn)可知,香菇在貯藏期間幾丁質(zhì)的含量是逐漸上升的[11]。由圖可知:在貯藏期間幾丁質(zhì)酶活性是呈下降趨勢(shì)的,到貯藏第12 d,輻照組與對(duì)照組的差異不顯著(p>0.05),從貯藏12 d開始,1 KGy組和2 kGy組與其他組相比差異顯著(p<0.05),1 KGy組的活性高于2 kGy組,說明1 KGy組能較好的抑制微生物的生長;同時(shí)能更好的延緩菇體組織的老化。
輻照保鮮是一種新型的的保鮮方式,它的原理是通過打破化學(xué)鍵,去除電子形成離子,自由基或ROS,并誘導(dǎo)水分解[29]。Xiong Q等[30]人研究發(fā)現(xiàn)合適劑量的輻照可以抑制雙孢菇開傘和發(fā)生褐變,降低了微生物污染的水平,并且延長了雙孢蘑菇的保質(zhì)期,而對(duì)感官特性沒有特別的影響。新鮮蘑菇采后變質(zhì)的速率直接與初始微生物的負(fù)荷有關(guān),伽瑪射線單獨(dú)使用或與冷藏結(jié)合已被證明通過減少水分損失、改善顏色和外觀來延長貨架壽命[31]。而高劑量輻照的缺點(diǎn)是破壞細(xì)胞分子氧進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),加快了氧化,引起褐變發(fā)生。
針對(duì)工廠化生產(chǎn)的大宗香菇來說,輻照保鮮技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)批量處理,在殺滅有害微生物、控制食源性污染的風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí),同時(shí)不改變香菇的自身的形貌,合適的劑量處理不僅不損耗其營養(yǎng)成分,而且還可以延長其貨架期。其中我們關(guān)注的是輻照處理對(duì)香菇自身代謝中酶的應(yīng)激反應(yīng),因?yàn)槊甘腔铙w組織中有催化功能的蛋白質(zhì),可調(diào)節(jié)組織細(xì)胞中特定的生化過程,對(duì)生物體內(nèi)的代謝起重要調(diào)節(jié)作用。
本研究中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GR)與香菇酶促抗氧化能力有密切關(guān)系;本研究中的苯丙氨酸解氨酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶與香菇的質(zhì)構(gòu)變化有密切關(guān)系。
其中苯丙氨酸解氨酶與多酚代謝和木質(zhì)素的形成有關(guān),而纖維素酶和幾丁質(zhì)酶與香菇細(xì)胞壁成分的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究中重點(diǎn)關(guān)注輻照處理對(duì)香菇貯藏過程中抗氧化相關(guān)酶和質(zhì)構(gòu)相關(guān)酶活的調(diào)控變化規(guī)律,為延緩菇體衰老,保持菇體營養(yǎng)和感官品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為高品質(zhì)鮮香菇的物流貯藏提供技術(shù)支撐。
4.1 香菇在采后容易受到外界環(huán)境和自身酶活等影響而發(fā)生品質(zhì)劣變,因此,采后保鮮的技術(shù)非常重要。輻照保鮮是一種無損的保鮮方式,能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
4.2 通過綜合分析不同輻照劑量對(duì)鮮香菇的微生物含量、質(zhì)構(gòu)特性、顏色變化以及相關(guān)酶等活性指標(biāo)的影響可知,相比其他劑量而言,其中1 KGy的輻照劑量結(jié)合低溫貯藏能較好地抑制其品質(zhì)劣變,能延長香菇的貯藏期限達(dá)到16~20 d。
4.3 輻照處理能夠有效地抑制采后香菇中的微生物侵染發(fā)生。對(duì)香菇輻照的劑量越大,殺菌效果越好,很大的抑制其嗜溫菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量增長,很好的延緩了菇體的腐爛。
4.4 香菇采后發(fā)生環(huán)境應(yīng)激反應(yīng),組織內(nèi)活性氧水平提高,導(dǎo)致其氧化產(chǎn)物積累,從而發(fā)生褐變。低劑量的輻照處理能延緩其SOD活性和GR活性的降低。木質(zhì)素、纖維素和幾丁質(zhì)等成分的增加是香菇采后品質(zhì)劣變的主要原因之一。由實(shí)驗(yàn)可知低輻照劑量能延緩PAL活性的增加,抑制纖維素酶活性和幾丁質(zhì)酶活性的降低,達(dá)到了抑制其老化的作用。綜合分析相關(guān)酶活性在貯藏過程中的變化可知1 KGy的抑制香菇老化的效果較好。