余軍 楊文彬 楊憲普 帥旗 趙越 張赟 朱實惠 蔣正東 吳建華 趙靜付建林

225300泰州，江蘇金迪克生物技術有限公司

中國是流感高發(fā)地區(qū)［1-2］，自1957年以來中國大陸和香港發(fā)生了幾次流感大流行，其病毒株也源于兩地［3-6］。流感和并發(fā)性肺炎在成人（≥40歲）死亡的主要原因中排名第四［7］。流感在老年人群中可引起高致病率和高病死率，隨著年齡增長，尤其70歲以上，除了由急性流感和繼發(fā)性細菌性肺炎造成的死亡外，流感還可增加缺血性心臟病、腦血管疾病、糖尿病人群的住院率和死亡率［8］。由于老年人免疫力低下，現(xiàn)有的流感疫苗對老年人的保護不力，疫苗效力低于青壯年（分別為68.6%和74%）［9］。疫苗免疫效力可能只有健康成人的60%并且效力隨著年齡增加及免疫力衰退的加劇而下降［8］。由于目前中國擁有世界上最大的老年人口（＞8 000萬），今后隨老年人口繼續(xù)增加，流感流行將造成更大的健康危害和社會經(jīng)濟負擔［10］。

目前世界上只有高劑量的三價疫苗和加佐劑標準劑量疫苗應用于≥65歲老年人群［11］，它們缺乏對另一譜系的B型流感病毒的預防，需要提供新型高劑量流感疫苗和新的接種方式以增加免疫原性并提供更多保護。國外迄今還沒有四價老年流感疫苗，國內尚無任何老年流感疫苗。本研究的目的是在本公司研發(fā)的四價流感病毒裂解疫苗的基礎上研制適用于老年高危群體的安全有效的流感疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 流感疫苗：采用2016—2017年流感季W(wǎng)HO推薦疫苗株：A1（A／California／7／2009，H1N1）、A3（A／Hong Kong／4801／2014）、B1（B／Brisbane／60／2008，B／Victoria）和 B2（B／Phuket／3073／2013，B／Yamagata），從英國國家生物標準與控制研究所（NIBSC）引進。采用本公司研制并經(jīng)檢定合格的流感病毒疫苗單價原液分別配制成標準劑量和高劑量試驗動物用疫苗（具體免疫劑量的計算參見2.2）。第一、二批試驗所用四型單價原液批號分別為：YA120161001（HA 含量 190 μg／ml）、YA320161001（HA 含量 286 μg／ml）、YB120161001（HA 含量 129 μg／ml）和 YB220161001（HA 含量 112 μg／ml）；第三批試驗所用四型單價原液批號分別為：YA120161003（HA 含量 231 μg／ml）、YA320161003（HA 含量 445 μg／ml）、YB120161003（HA 含量 251 μg／ml）和 YB220161003（HA 含量 286 μg／ml）；標準劑量兩針試驗所用四型單價原液批號分別為：YA120170601（HA 含量 199 μg／ml）、YA320170601（HA 含量 273 μg／ml）、YB120170601（HA 含量 106 μg／ml）、YB220170601（HA 含量 277 μg／ml）。

1.1.2 主要試劑及儀器：A1（H1N1）、A3（H3N2）、B1（B／Victoria）和 B2（B／Yamagata）流感病毒標準抗原參考品、標準抗體參考品均來源于NIBSC；霍亂濾液購自美國SIGMA公司；氯化鈉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純產(chǎn)品；三用電熱恒溫水箱購自天津市泰斯特儀器有限公司，型號為SHHW21-420；純水儀Milli-Q低熱原型購自法國Millipore公司，型號為A10；漩渦震蕩儀購自IKA公司，型號為V2S025；臺式低速離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號為L500；數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司，型號為KQ5200DE。

1.2 免疫原性試驗

1.2.1 實驗動物：SPF級KM小鼠，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。隨機分組，每籠5～6只。

1.2.2 免疫劑量：近年來新藥藥效研究中多以以下公式計算實驗動物給藥劑量：

其中D為藥物劑量，K為常數(shù)，W為動物體重（Kg），人及不同種類動物的K值不同，如人10.6、小鼠9.1［12］。根據(jù)以上給藥公式及現(xiàn)在市場上常規(guī)注射流感疫苗的血凝素含量15μg／株／劑。計算小鼠標準劑量肌肉注射流感疫苗血凝素含量應為4.5μg／株／劑［13］。

本試驗使用的高劑量流感疫苗每株血凝素的濃度為18μg／株／劑是標準劑量的4倍［14］。將單價原液分別配制為高劑量、標準劑量四價流感病毒裂解疫苗和高劑量、標準劑量A＋B套苗，其中A苗含A1和A3型血凝素高劑量為各18μg／株／劑，標準劑量為各4.5μg／株／劑，B苗含B1和B2型血凝素高劑量為各18μg／株／劑，標準劑量為各4.5μg／株／劑，并分兩次接種小鼠，下文中均根據(jù)A＋B套苗接種先后順序稱為先A苗后B苗或先B苗后A苗。

1.2.3 試驗設計

1.2.3.1 免疫劑量及次數(shù)試驗分組：將小鼠隨機分為7組，試驗組每組12只以上，分別為：高劑量單次免疫組、高劑量先A苗后B苗組、高劑量先B苗組后A苗組、標準劑量單次免疫組、標準劑量先A苗后B苗組、標準劑量先B苗后A苗組及PBS對照組。重復3次。

1.2.3.2 高劑量二針間隔時間選擇試驗分組：將小鼠隨機分為9組，分別為：先A苗后B苗間隔3 d組、7 d組和10 d組；先B苗后A苗間隔3 d組、7 d組和10 d組。其中試驗組每組15只，對照組每組5只。

1.2.3.3 免疫方法和采血時間：每只小鼠經(jīng)后腿肌肉注射，注射量控制在0.25 ml以內。兩次免疫的小鼠，免疫間隔均為7 d。單次免疫和第二次免疫后21 d，小鼠眼眶采血，分離血清，置-20℃保存待測。1.2.4 血凝抑制試驗：每份血清經(jīng)霍亂濾液處理，進行血凝抑制試驗，測定其抗體滴度。血凝抑制試驗使用來自NIBSC的標準抗原及標準血清以確定和配制血凝抑制試驗中所使用的四個血凝單位的抗原濃度。采用微量半加敏法測定每份小鼠血清的抗血凝素抗體滴度。

1.2.5 免疫原性的判定：抗體滴度為采用血凝抑制法（HI）測定血清中對所有的原型病毒株的抗血凝素抗體，以達到完全抑制凝集最高稀釋度的倒數(shù)表示。同時設有陽性和陰性血清的參考標準。血凝抑制效價≥40，判為陽性血清；效價 ＜40，為陰性血清［13］。

表1 不同免疫劑量及次數(shù)試驗陽轉率Tab.1 Seroconversion rate of the assay of immunization dose and frequency

1.3 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計各組小鼠血清陽轉率及血凝抑制抗體幾何平均滴度（HI GMT）［3］。血凝抑制試驗實驗結果以平均幾何滴度±標準差表示。為便于計算，任何 HI＜10表示為5［13］。 運用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件對各組試驗數(shù)據(jù)進行Mann Whitney test檢驗對抗體水平進行顯著性檢驗分析，以P＜0.05為顯著性差異。“?”表示P＜0.05，“??”表示P＜0.01，“???”表示 P ＜0.001。

2 結果

本實驗測定動物免疫后血清中抗血凝素抗體滴度，并計算血清陽轉率和抗血凝素抗體幾何平均滴度。

2.1 比較動物接種不同劑量次數(shù)、陽轉率和抗血凝素抗體 測定7組共261份小鼠血清的抗血凝素抗體滴度。

2.1.1 計算各組陽轉率：除高劑量組、標準劑量組和PBS組的單次注射組外，其余先A苗后B苗組、先B苗后 A苗組均為兩針注射，間隔7 d，重復3次。

表1結果顯示，高劑量單次免疫組和高劑量A＋B套苗組免疫動物血清中抗各種血凝素抗體均呈現(xiàn)高的陽轉率。高劑量單次免疫組血清中抗各種血凝素抗體的陽轉率遠高于標準劑量的單次免疫組，A3型除外。高劑量A＋B套苗組血清中抗各種血凝素抗體的陽轉率與標準劑量A＋B套苗組陽轉率相近似，高劑量A＋B套苗組血清中抗B1型血凝素抗體陽轉率遠高于標準劑量A＋B套苗組。無論是高劑量還是標準劑量，兩次免疫組陽轉率均高于單次免疫組。整體表明，高劑量組血清陽轉率優(yōu)于標準劑量組，兩次免疫組優(yōu)于單次免疫組。

2.1.2 高劑量和標準劑量單次免疫動物后抗血凝素抗體反應：對單次免疫時高劑量與標準劑量組抗血凝素抗體滴度比較顯示（表2），高劑量單次免疫組抗各種血凝素抗體滴度均高于標準劑量單次免疫組，特別是 A1、B1和 B2（P ＜0.001），PBS組無抗血凝素抗體產(chǎn)生。

2.1.3 比較A＋B套苗免疫后動物抗體反應

2.1.3.1 比較標準劑量A＋B套苗免疫后動物抗體反應：先A苗后B苗組或先B苗A苗組，進行兩次免疫，間隔7 d。

表3結果顯示標準劑量A＋B套苗無論是先A苗后B苗組，還是先B苗后A苗組，各中抗血凝素抗體滴度均高于表2中標準劑量單次免疫組。

2.1.3.2 比較高劑量A＋B套苗免疫動物后抗體反應：無論是高劑量組中（表2和表4）還是在標準劑量組中（表2和表3），在免疫總劑量相同時，A＋B套苗兩次免疫的效果優(yōu)于單次免疫。

表2 單次免疫高劑量組與標準劑量組免疫后抗血凝素抗體滴度比較Tab.2 Comparison of the HI titers of one high and standard dose groups

表3 標準劑量A＋B套苗兩次免疫組抗血凝素抗體滴度比較Tab.3 Comparison of the HI titers of standard dose A＋B serial vaccine groups

表3和表4中有更令人注意的一致性結果：高劑量A＋B套苗和標準劑量A＋B套苗如采取先A苗后B苗的免疫方式，其抗B1和B2的血凝素抗體滴度高于先B苗后A苗組中的抗B1和B2的血凝素抗體滴度；反之，如采取先B苗后A苗的免疫方式，其抗A1和A3型血凝素抗體滴度高于先A苗后B苗組的抗A1和A3型血凝素抗體滴度。除高劑量先A苗后B苗組抗B1型血凝素抗體滴度與先B苗后A苗組抗B1型血凝素抗體滴度差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組相應型別的抗血凝素抗體滴度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.2 高劑量A＋B套苗免疫兩次的時間選擇 為了進一步探究A＋B套苗兩次免疫的間隔時間對抗體產(chǎn)生的影響，設高劑量單次免疫組、先A苗后B苗組、先B苗A苗組為實驗組，PBS對照組，試驗組動物總數(shù)為15只，對照組為5只，測其單次免疫和間隔3 d、7d和10 d兩次免疫的小鼠血清中的抗血凝素抗體滴度和陽轉率。

表4 高劑量A＋B套苗兩次免疫組抗血凝素抗體滴度比較Tab.4 Comparison of the HI titers of HD A＋B serial vaccine groups

本次試驗高劑量單次免疫組和先A苗后B苗組、先B苗后A苗組免疫最終血凝素總含量都為72μg。

學科核心素養(yǎng)是學科育人的集中體現(xiàn)，是學生通過學科學習而逐步形成的正確價值觀念、必備品格和關鍵能力。語文學科核心素養(yǎng)是學生在積極的語言實踐活動中積累與構建起來，并在真實的語言運用情境中表現(xiàn)出來的語言能力及其品質；是學生在語文學習中獲得的語言知識與語言能力，思維方法與思維品質，情感、態(tài)度與價值觀的綜合體現(xiàn)。主要包括“語言建構與運用”“思維發(fā)展與提升”“審美鑒賞與創(chuàng)造”“文化傳承與理解”四個方面。那么，如何通過語文教學提升學生的語文學科素養(yǎng)呢？筆者認為，閱讀和表達能力的培養(yǎng)是提升學生語文學科素養(yǎng)的根本途徑和基本手段。

從表5可見，當先接種B苗，隔7 d再接種A苗時，除對A3和B1型抗原的血清陽轉率為93.33%外，其他各組對四型抗原的血清陽轉率均為100%。該結果表明，兩次免疫的間隔時間及免疫先后順序對A＋B套苗血清陽轉率的影響沒有顯著差異。

表5 高劑量A＋B套苗兩次免疫間隔時間和陽轉率Tab.5 Seroconversion rate of the immunization intervals of HD A＋B serial vaccine

兩次免疫時間間隔的選擇是以抗血凝素抗體滴度的高低來確定最優(yōu)免疫時間間隔。測定一次高劑量和兩次高劑量A＋B套苗分別間隔3、7、10 d的抗血凝素抗體滴度，見表6。

從表6可見，高劑量A＋B套苗組和高劑量的單次免疫組所使用的血凝素總劑量相同，在高劑量A＋B套苗組，兩次免疫間隔3、7、10 d的動物血清抗血凝素抗體滴度高于高劑量單次免疫。高劑量A＋B套苗7 d和10 d組的各項抗血凝素抗體滴度均高于3 d組。同時再次證實，與表2和表3中的結果一致。先A苗后B苗組中，抗B型血凝素抗體滴度增加顯著；先B苗后A苗組中，抗A型血凝素抗體滴度明顯增加，P＜0.001。

表6 高劑量A＋B套苗免疫間隔時間對動物產(chǎn)生抗血凝素抗體滴度的比較Tab.6 The effect of immunization intervals on the immunogenicity of different antigens

3 討論

每年都有A型和B型流感病毒引起的季節(jié)性流感，特別是老年人群易受流感病毒感染，造成高發(fā)病率和病死率。流感疫苗是預防季節(jié)性流感的最佳手段，但是我國老年人群接種疫苗的比例不足僅5%。因為老年人免疫力低下、免疫反應較差［15］，傳統(tǒng)的標準流感疫苗對老年人群的保護力不夠，并隨著年齡增加而下降。因此需要研制更有效的疫苗。有臨床研究證明，提高疫苗中流感血凝素含量的高劑量疫苗可在老年人群中誘導比標準劑量疫苗更高的免疫反應［8］。目前國外沒有四價高劑量老年流感疫苗，國內尚無任何老年流感疫苗。

賽諾菲公司進行的高劑量三價流感疫苗Fluzone 的研究表明［11，16］，高劑量 Fluzone 在65 歲以上老年群體中預防流感時，比標準劑量Fluzone更有效，產(chǎn)生的血清抗體滴度顯著高于標準劑量Fluzone，是安全性的。高劑量的三價Fluzone疫苗每針劑中每株血凝素含量為60μg，總血凝素含量為180μg；標準劑量的三價Fluzone疫苗每針劑中每株血凝素含量為15μg，總血凝素含量為45μg。賽諾菲高劑量三價Fluzone疫苗是2009年12月獲得FDA批準上市，由Glaxo Smith Kline公司生產(chǎn)四價流感疫苗Fluarix于2012年7月20日經(jīng)FDA批準上市［17］。歷經(jīng)多年，并無高劑量四價流感疫苗出現(xiàn)，其原因可能是，若按高劑量三價流感疫苗的配方，每劑四價高劑量的流感疫苗，每株病毒血凝素含量為60μg，其總血凝素含量高達240μg。隨著血凝素含量的增加可以推測其注射后副反應相應增加。因此，本研究設計老年高劑量四價流感疫苗A＋B套苗，將疫苗分為A苗和B苗，分兩次免疫，如用于人群免疫，每次總血凝素含量不超過120μg，低于高劑量三價疫苗血凝素總量，其注射后免疫反應應隨之減少而更安全。當然，對于已有高劑量三價流感疫苗，是否可以通過增加注射一次高劑量另一B型血凝素達到加強免疫反應還有待驗證，也不失為一種研制老年流感疫苗的新途徑。

高劑量A＋B套苗中高血凝素含量可增加疫苗免疫原性，誘生更高水平的抗血凝素抗體。高劑量的A＋B套苗如果采用先A苗后B苗的免疫方式，其抗B1和B2型的血凝素抗體滴度高于先B苗后A苗組；反之，如先B苗后A苗的免疫方式，其抗A1和A3型的血凝素抗體滴度高于先A苗后B苗組。同樣的結果在標準劑量的A＋B套苗組等試驗中證實。因此，可根據(jù)當年對A型和B型流感病毒流行病學監(jiān)測，選擇或改變使用先A苗后B苗或者是先B苗后A苗的免疫順序，增加疫苗的保護效果。

免疫間隔時間試驗結果則再次證明了高劑量A＋B套苗相對于高劑量單次免疫疫苗在免疫原性方面的顯著優(yōu)越性，間隔7 d和10 d的免疫反應優(yōu)于間隔3 d，原因是流感病毒A型和B型抗原間存在共同抗原［18］，在第2次免疫對共同抗原產(chǎn)生更高的免疫應答，提供第2次免疫時間可靈活選擇7～10 d。

本研究研發(fā)高劑量四價流感A＋B套苗，為免疫力低下、對高劑量疫苗的副反應耐受性差的高危老年人群提供一種安全有效、新型老年流感疫苗和免疫模式。

利益沖突 無