查濤 鄧昊敏 殷盼盼

241000蕪湖市疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室

諾如病毒是所有年齡組中引起腸胃炎的最常見的原因，在學(xué)校、醫(yī)院、療養(yǎng)院、游輪和軍隊(duì)等聚集場(chǎng)所均有暴發(fā)［1-3］。在國(guó)內(nèi)，諾如病毒引起的暴發(fā)疫情主要出現(xiàn)在春冬季，但其他季節(jié)也有出現(xiàn)［3］。諾如病毒屬于杯狀病毒科諾如病毒屬、具有小圓結(jié)構(gòu)的單股正鏈、無包膜的RNA病毒?；蚪M全長(zhǎng)約7.6Kb，包含三個(gè)開放閱讀框架（ORF），編碼8個(gè)病毒蛋白。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2和ORF3分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白（viral protein 1，VP1）和次結(jié)構(gòu)蛋白VP2。根據(jù)VP1的全基因序列不同，可分為5個(gè)基因組（GⅠ～GⅤ）［4］，人類感染諾如病毒頻率按 GⅡ、GⅠ、GⅣ依次遞減［5-6］。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于2017年蕪湖市轄區(qū)內(nèi)7起諾如病毒暴發(fā)疫情與10起聚集性疫情，共收集133份肛拭子標(biāo)本和4份嘔吐物標(biāo)本。

表1 GⅡ.2型毒株14株代表株序列之間的同源矩陣Tab.1 Sequence homology matrix of GⅡ.2 genotype among 14 representative strains

1.2 標(biāo)本預(yù)處理 將0.2 g或200μl嘔吐物標(biāo)本加入標(biāo)本處理液，振蕩3次，每次10 s。靜置10 min，然后4℃ 8 000×g離心5 min，吸取上清進(jìn)行下步試驗(yàn)或-20℃保存?zhèn)溆?。肛拭子?biāo)本置病毒采樣管內(nèi)，充分振蕩混勻，靜置10 min備用。

1.3 病毒RNA提取 取預(yù)處理標(biāo)本200μl，采用Roche公司 High Pure Viral RNA Kit（批號(hào)：1185 8882001）病毒RNA提取試劑盒和MagNA Pure LC 2.0 System提取儀進(jìn)行病毒RNA提取。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 采用江蘇碩世熒光定量PCR試劑盒（GⅠ、GⅡ）和ABI7500熒光定量PCR進(jìn)行初步分型檢測(cè)。

1.5 分型引物擴(kuò)增 采用TaKaRa公司PrimeScriptTMOne StepRT-PCR Kit Ver.2 （Dye Plus）（批號(hào)：RR057A）和分型引物擴(kuò)增（COG2F：5′-CARGAR BCNATGTTYAGRTGGATGAG-3′；G2-SKR： 5′-CCR CCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′）［7］，片段大小 387 bp。對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系30μl，將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因公司測(cè)序。 將測(cè)序結(jié)果在 http：／／www.rivm.nl／mpf／typingtool／norovirus／進(jìn)行分型。 利用 Blast比對(duì)，MAGA5.0軟件Neighbor-Joinig構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和用R語(yǔ)言計(jì)算序列之間的同源性，分析毒株之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 2017年全年諾如病毒暴發(fā)疫情和聚集性疫情均發(fā)生于學(xué)校（小學(xué)和幼兒園），時(shí)間分布于1～5月份和11～12月份，6～10月份之間無疫情報(bào)告。暴發(fā)疫情全部集中于1～3月份，其他月份均未發(fā)生。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 對(duì)諾如病毒暴發(fā)疫情與聚集性疫情的137份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示77份諾如病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性，且全部為GⅡ型。

2.3 序列測(cè)定 將77份實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果陽(yáng)性的標(biāo)本，通過特異性引物擴(kuò)增，測(cè)序成功40份。

2.4 分型 將44株諾如病毒序列，在http：／／www.rivm.nl／mpf／typingtool／norovirus／網(wǎng)上初步比對(duì)，引起2017年蕪湖市轄區(qū)內(nèi)的7起暴發(fā)疫情的諾如病毒只有兩個(gè)型別GⅡ.3（4株）和GⅡ.2（21株），其中GⅡ.3型1起，GⅡ.2型6起。諾如病毒聚集性疫情一共10起，8起由GⅡ.2（16株）型引起，還有2 起是由 GⅡ.4 Sydney＿2012（3 株）引起。

2.5 核苷酸序列分析 選取由GⅡ.2型毒株引起的疫情（6起暴發(fā)，8起聚集性）每起疫情選1株代表株，一共14株，用R語(yǔ)言計(jì)算序列之間的同源性（表1）。提示這些毒株之間，有較高的同源性。

圖1 基于諾如病毒GⅡ型C區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on C region of norovirus GⅡ

將所有序列基于C區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）。提示37株GⅡ.2型毒株與參考株在同一簇上，具有較近的親緣關(guān)系。3株GⅡ.3與參考（Hu／GII.3／Zhenjiang／Jiangsu／2015／CHN， GenBank 號(hào)KY433576.1）在同一簇上，經(jīng)blast分析，兩者核苷酸序列同源性為99%，2起起聚集性疫情的GⅡ.4 Sydney＿2012毒株核苷酸序列之間的同源性為96%，與參考株 （Norovirus 15-IB-2／2015／GII.Pe／GII.4 Sydney＿2012，GenBank 號(hào) ku678201.1）同源性94%～98%。

3 討論

諾如病毒感染是急性腸胃炎暴發(fā)主要原因之一，好發(fā)于春冬季，主要傳播途徑是糞口途徑。此外還可以通過空氣傳播、通過食物和水以及污染的環(huán)境傳播。2017年蕪湖市17起諾如病疫情主要分布于學(xué)校（小學(xué)和幼兒園）這種復(fù)雜的環(huán)境，諾如病毒復(fù)雜多樣的傳播方式都有可能從學(xué)校的暴發(fā)疫情中體現(xiàn)，特別是對(duì)無癥狀排泄者的控制，加大了疫情的防控難度［8］。雖然近些年來全國(guó)范圍內(nèi)GⅡ.2亞型引起的暴發(fā)疫情逐漸增多，但是諾如病毒GⅡ.2引起的暴發(fā)疫情在安徽省內(nèi)少有報(bào)道［9］。然而2017年蕪湖地區(qū)諾如病毒引起的7起暴發(fā)疫情中，GⅡ.2型毒株引起暴發(fā)疫情就有6起，10起聚集性疫情中8起是由GⅡ.2型引起，提示很有可能今后的一段時(shí)間內(nèi)GⅡ.2型將成為蕪湖地區(qū)甚至安徽省內(nèi)諾如病毒疫情的優(yōu)勢(shì)流行毒株。本研究的引起14起疫情（6起暴發(fā)疫情，8起聚集性疫情）的14株GⅡ.2毒株之間高度同源，提示可能有統(tǒng)一來源。本次檢出的GⅡ.4 Sydney＿2012變異株也是引起諾如病毒疫情常見毒株，2012年在全球各地都有暴發(fā)［10］，江蘇、廣東等地都出現(xiàn)過暴發(fā)流行［11］，但近幾年暴發(fā)疫情較少，可能與毒力降低或與人群對(duì)GⅡ.4 Sydney＿2012毒株免疫力提高了有關(guān)。GⅡ.3引起的暴發(fā)疫情，報(bào)道較少，屬安徽省首例。本次檢出的GⅡ.3與鎮(zhèn)江株有較高的同源性，蕪湖與鎮(zhèn)江同屬于沿江城市，并在其上游，諾如病毒容易通這水源向下傳播，提示GⅡ.3毒株在2015年鎮(zhèn)江株檢出之前就可能存在了。諾如病毒存在遺傳多樣性，不同型別之間存在重組可能性。鑒于蕪湖地區(qū)有多種諾如病毒亞型存在，不同型別之間的重組也極可能發(fā)生。因此加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)諾如病毒分子分型研究，不僅有利于了解蕪湖地區(qū)諾如病毒的進(jìn)化、演變情況，也能為分子流行病學(xué)積累寶貴資料，進(jìn)而為蕪湖市諾如病毒疫情防控提供技術(shù)支撐。

利益沖突無