裴芳霞

（黔南州糧油質(zhì)量檢測中心，貴州都勻558000）

隨著化石能源的日益枯竭，生物能源的開發(fā)不僅有助于緩解日益嚴(yán)重的能源危機(jī)，還能減輕對地球溫室效應(yīng)和霧霾天氣影響。木質(zhì)纖維生物質(zhì)各組分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，彼此關(guān)聯(lián)。纖維素和半纖維素鏈內(nèi)和鏈間主要通過氫鍵連接，木質(zhì)素內(nèi)部除了有強(qiáng)大的氫鍵連接外，還與半纖維素形成穩(wěn)定的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體。三者相互交織的結(jié)構(gòu)決定了任何一類成分的降解必然受到其他成分的制約，如木質(zhì)素對纖維素和半纖維素酶解過程的空間位阻作用，很難使水解酶直接作用于底物，導(dǎo)致酶解效率和糖得率較低[1]。因此，需要通過預(yù)處理技術(shù)破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)，改變木質(zhì)素與半纖維素周圍的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高酶與底物的接觸面積，使其在酶作用下降解為可發(fā)酵糖，這也是燃料乙醇轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟和技術(shù)瓶頸[2]。

近年來在關(guān)于白腐真菌預(yù)處理的研究報(bào)告中，部分研究者認(rèn)為，白腐菌預(yù)處理后酶解率提高的主要原因可能是預(yù)處理過程增加原料的多孔性，降低其結(jié)晶度，導(dǎo)致部分木質(zhì)素被去除，木質(zhì)纖維原料網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，增加酶與底物的可及性，使碳水化合物轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化率提高[3-5]。Sun等[6]研究T.hirsutayj9預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，T.hirsutayj9預(yù)處理42 d后秸稈中木質(zhì)素的降解率達(dá)到71.49%，最主要的木質(zhì)素降解和水解酶漆酶和木聚糖酶的濾紙酶活性隨著處理時(shí)間的增加逐漸增加。

本實(shí)驗(yàn)主要對白腐菌生長曲線、白腐菌固態(tài)發(fā)酵時(shí)間對酒糟組分及酶解效果的影響進(jìn)行研究，以及白腐菌結(jié)合超聲波預(yù)處理的酒糟進(jìn)行纖維素酶和木聚糖酶的水解，評價(jià)白腐菌預(yù)處理酒糟對纖維素酶和木聚糖酶水解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒糟，甘肅金徽酒股份有限公司提供，自然晾干后粉碎過40目篩備用。主要組分成分為：纖維素27.42%，木質(zhì)素9.7%，半纖維素21.86%，蛋白質(zhì)12.45%，脂肪3.02%，灰分9.05%（以干基計(jì)）。

黃孢原毛平革菌（P.chaysosporium），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

纖維素酶(濾紙酶活力為10萬U/g)和木聚糖酶(酶活力為5萬U/g)，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；間苯三酚，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；D-木糖，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其余試劑為分析純。

1.2 主要儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Cary50紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SB-JC-IB超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-82恒溫培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種保藏

將P.chaysosporium接種于PDA培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)，待白色的孢子鋪滿平板時(shí)，將平板轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，每月接種1次。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

1.3.2.1 培養(yǎng)基的制備[7]

固體培養(yǎng)基（即PDA培養(yǎng)基）（g/L）：馬鈴薯提取液1.0 L、葡萄糖20.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，酵母膏0.1，瓊脂15.0，pH6.0。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO420.0，MgSO4·7H2O 5，CaCl21。

微量元素混合液（g/L）：氨基乙酸 1.5，MgSO4·7H2O 3，MnSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CoCl2·6H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，KAl(SO4)2·12H2O 10 mg/L，H3BO410 mg/L，Na2MoO4·2H2O 10 mg/L，pH 6.5。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，酒石酸銨2.0，維生素B 11.2，400 mμ藜蘆醇1 mL，0.2 M醋酸鈉緩沖液（pH4.5）100 mL，液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 mL，微量元素混合液50 mL。

1.3.2.2 菌懸浮液的制備

在無菌條件下，用接種環(huán)將PDA平板培基上的菌膜刮到無菌水中，30℃振蕩培養(yǎng)2 h后，用脫脂棉過濾，得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板測定菌懸液中的菌落單位數(shù)，測定菌懸液濃度在5×105cfu左右。

1.3.3 生物量的測定（以菌體干重計(jì)）

1.3.3.1 制備具有酶活性的菌液

將配制好的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝到20個(gè)100 mL的錐形瓶中，各裝50 mL，用透氣膜封口，在121℃、101 kPa下滅菌20 min，然后用移液槍移取2 mL菌懸液于其中的18個(gè)錐形瓶中，另外兩個(gè)作為對照組，將接種菌液的錐形瓶放置在30℃振蕩培養(yǎng)箱中（150 r/min)進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔12 h測定1次生物量。

1.3.3.2 生物量的測定

將液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的菌絲體用真空泵抽濾，抽濾前濾紙片烘干后的質(zhì)量計(jì)為m1，菌體和濾紙恒重后的質(zhì)量計(jì)為m2，則菌體干重為：m=m2-m1。

1.3.3.3 制作生長曲線

生物量增長最快的點(diǎn)為菌體對數(shù)期生長點(diǎn)，選該時(shí)間點(diǎn)為最佳產(chǎn)酶期。

1.3.4P.chaysosporium處理

準(zhǔn)確稱取10 g酒糟于250 mL錐形瓶中，按1∶2.5(m/v)的比例加入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，用封口膜封口后，121℃高溫滅菌20 min，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。接種菌懸液，保持接種量為30%(g∶mL)，封口后，將錐形瓶移入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d，所有樣品均設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后，將錐形瓶放入105℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后用自封袋保存待測。

1.3.5 酶解處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g預(yù)處理殘?jiān)?，纖維素酶和木聚糖酶添加量為5000 U/g和4000 U/g進(jìn)行酶解，酶解液用于測定還原糖和木糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃孢原毛平革菌接種菌齡的確定（圖1）

由圖1可知，在P.chaysosporium接種初期處于休眠狀態(tài)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲體重量開始緩慢增加，但當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到120 h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其干重增長迅速，且在132 h時(shí)增長最快，說明菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，在該階段菌體生命力旺盛，是最佳接種期，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到156 h后，菌絲體干重達(dá)到最大，并在156～192 h內(nèi)基本保持不變，即產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，進(jìn)入產(chǎn)酶階段。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過192 h時(shí)，菌絲體干重急速下降，說明菌體開始衰亡。菌種活性直接關(guān)系到發(fā)酵液中酶活的高低。為了提高酶解效果，接種時(shí)間應(yīng)選在菌體對數(shù)期，因此該菌體的接種種齡為120 h[8]。

2.2 P.chaysosporium預(yù)處理時(shí)間對酶解效果的影響（圖2）

圖2 P.chaysosporium預(yù)處理對酶解效果的影響

由圖2可看出，P.chaysosporium預(yù)處理時(shí)間對預(yù)處理效果的影響意義重大。固態(tài)發(fā)酵時(shí)間在0～8 d范圍內(nèi)，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長，還原糖和木糖得率呈逐漸增加趨勢，但是相對木糖得率而言還原糖得率增加趨勢明顯。當(dāng)處理時(shí)間為8 d時(shí)，預(yù)處理樣品酶解液中還原糖和木糖得率達(dá)到最大值，分別為60.55%、21.33%。繼續(xù)延長預(yù)處理時(shí)間，還原糖和木糖得率逐漸下降?？赡艿脑蚴?，過長的預(yù)處理時(shí)間導(dǎo)致木質(zhì)素被降解，致使更多的纖維素暴露出來利于與酶結(jié)合，提高酒糟中纖維素和半纖維素與酶的可及性，從而提高酶水解得率[9]。

2.3 P.chaysosporium預(yù)處理對酒糟組分的影響

由表1可知，隨著P.chaysosporium預(yù)處理時(shí)間的延長，綜纖維素保留率和木質(zhì)素降解率均呈先增加后減小的趨勢，且在培養(yǎng)時(shí)間為8 d時(shí)，綜纖維素保留率和木質(zhì)素的降解率最好，分別為76.85%和26.44%。同時(shí)造成綜纖維素部分損失。謝菊蘭[10]在用白腐真菌降解稻草木質(zhì)纖維素的研究中表明，稻草接種菌F1和F2后木質(zhì)素的降解率可達(dá)39.32%和34.29%。黃慧等[11]研究P.chaysosporium對玉米秸稈木質(zhì)素的降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，在秸稈粒度4～5 cm，接種黃孢原毛平革菌培養(yǎng)35 d后，木質(zhì)素降解率累計(jì)率為45.2%。

2.4 酒糟P.chaysosporium預(yù)處理前后結(jié)構(gòu)變化分析

2.4.1 電鏡掃描（SEM）分析（圖3）

由圖3可知，與酒糟原料相比經(jīng)P.chaysosporium預(yù)處理后殘?jiān)⒛举|(zhì)纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表面出現(xiàn)凹槽、不規(guī)則孔洞和部分脫落碎屑，結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)界限模糊。殘?jiān)?jīng)酶解處理，原有的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步變得疏松，纖維素分子無定形區(qū)消失，結(jié)晶區(qū)表面被完全破壞。

表1 P.chaysosporium處理過程中酒糟組分的變化

圖3 酒糟P.chaysosporium預(yù)處理及酶解殘?jiān)婄R掃描圖(×2000)

2.4.2 X衍射（XRD)分析（圖4）

根據(jù)圖 4可知，酒糟在 2θ為 13.10°、21.90°和25.99°處有3個(gè)衍射峰，其中2θ=13.10°處左右的弱峰代表纖維素?zé)o定形區(qū)，2θ=21.90°代表結(jié)晶區(qū)強(qiáng)度的002面衍射峰。經(jīng)P.chaysosporium預(yù)處理及酶解后纖維素?zé)o定型區(qū)消失，在2θ=22°附近處出現(xiàn)衍射峰，但峰尖不再尖銳[12]。利用Segal經(jīng)驗(yàn)公式得酒糟原料、P.chaysosporium處理殘?jiān)⒚附鈿堅(jiān)慕Y(jié)晶度分別為25.21%、50.40%和43.67%。表明預(yù)處理和酶解能夠提高酒糟相對結(jié)晶度，可能的原因是，預(yù)處理使得木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)破壞，纖維素分子暴露，尤其是結(jié)晶區(qū)的暴露導(dǎo)致002面衍射峰強(qiáng)度增強(qiáng)，結(jié)晶度提高。

圖4 酒糟P.chaysosporium預(yù)處理及酶解前后X衍射圖譜

2.4.3 紅外光譜（FTIR）分析（圖5）

由圖5紅外光譜分析可知，酒糟經(jīng)P.chayso-sporium預(yù)處理后在1310 cm-1、1030 cm-1和833 cm-1處的吸收峰發(fā)生變化明顯，而此處的吸收峰分別代表C-H彎曲振動(dòng)和纖維素分子內(nèi)醚的C-C骨架的伸縮振動(dòng)，由上述吸收峰的歸屬可知酒糟中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等成分，復(fù)合木質(zhì)纖維生物質(zhì)特征。酒糟經(jīng)P.chaysosporium預(yù)處理及酶解后有明顯的芳香環(huán)骨架振動(dòng)伸縮振動(dòng)峰1640 cm-1，故可知P.chaysosporium預(yù)處理及酶解過程并未破壞木質(zhì)素芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。酒糟經(jīng)P.chaysosporium作用及酶解后，在1030 cm-1處吸收峰明顯減弱，說明半纖維素被部分降解，故可知，P.chaysosporium處理及酶解前后的譜峰位置基本一致，但吸收峰強(qiáng)度發(fā)生變化，說明酒糟的結(jié)構(gòu)被修飾[13]。

圖5 酒糟P.chaysosporium預(yù)處理及酶解前后紅外光譜圖

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，隨著P.chaysosporium預(yù)處理時(shí)間的延長，酶解液中還原糖和木糖得率均呈先上升后下降的趨勢,且在P.chaysosporium固態(tài)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，酶解液中還原糖和木糖得率達(dá)到最大值，分別為60.55%和22.12%，與未處理組相比，增長率分別為49.22%和25%。此時(shí)預(yù)處理殘?jiān)芯C纖維素的保留率和木質(zhì)素的降解率分別為76.85%和26.44%。