祝傳書,劉 艷,陳蒙蒙,蒲 時,馮俊濤,張 興
(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心,陜西楊陵 712100;2 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心,陜西楊陵 712100)
雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)為衛(wèi)矛科雷公藤屬多年生木質(zhì)藤本植物,在中國很早以前就用于醫(yī)學(xué)和防治各種害蟲,是一種重要的殺蟲植物和傳統(tǒng)的中藥材,主要分布于東南亞以及中國長江流域以南等地區(qū)。在農(nóng)業(yè)上對多種害蟲具有胃毒、觸殺、拒食、抑制發(fā)育等活性。在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,雷公藤植物提取物具有抗癌、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[1]。雷公藤植物因根入藥,野生資源生長緩慢,大量采摘造成雷公藤野生資源日益減少,使得雷公藤植物活性化合物的應(yīng)用受到限制。通過離體培養(yǎng)并結(jié)合雷公藤活性次生代謝物質(zhì)生物合成途徑的調(diào)控,成為提高雷公藤植物次生代謝物質(zhì)含量以及利用代謝工程與合成生物學(xué)手段獲取活性次生代謝物質(zhì)的有效途徑。
轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)也稱反式作用因子,是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、能與真核生物的基因啟動子區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合,從而調(diào)控目的基因表達的蛋白質(zhì)分子[2]。AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive element binding factor)轉(zhuǎn)錄因子家族,也稱AP2/EREBP,廣泛存在于植物中,其家族成員均含有由60個左右氨基酸組成的保守DNA結(jié)合域,即AP2/EREBP結(jié)合域[3]。近年來已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[4]、大豆(Glycinemax)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、葡萄(Vitisvinifera)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]等多種植物中分離獲得。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程,包括生長發(fā)育、生物和非生物脅迫(如干旱、高鹽、低溫等)逆境脅迫響應(yīng)等[9-12]。近期研究發(fā)現(xiàn),植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控多種藥用植物的次生代謝產(chǎn)物生物合成。青蒿(Artemisiaannua)中分離的2個茉莉酸(jasmonic acid, JA)響應(yīng)的AP2(APETALA2)家族轉(zhuǎn)錄因子AaERF1和AaERF2,它們能夠與青蒿素合成途徑關(guān)鍵酶基因的啟動子結(jié)合,調(diào)控關(guān)鍵酶基因的協(xié)同表達,影響合成青蒿素前體紫穗槐-4,11-二烯到青蒿酸的生物合成,最終影響青蒿素的含量[13]。青蒿中表皮毛特異表達的轉(zhuǎn)錄因子AaORA(A.annuaoctadecanoid-responsive AP2/ERF-domain transcription factor)可調(diào)控青蒿素合成關(guān)鍵酶基因的表達水平,從而調(diào)控青蒿素和青蒿酸的合成[14]。而且調(diào)控毛狀體和青蒿素生物合成途徑的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子TAR1(trichome and artemisinin regulator 1)也可直接作用于青蒿素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因,從而調(diào)控青蒿素生物合成[15]。從紫杉(Taxuscuspidata)中分離的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子TcAP2,可通過調(diào)控紫杉醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達而增加紫杉醇的積累,而AP2類轉(zhuǎn)錄因子TcDREB(T.cuspidatadehydration response element binding)也參與調(diào)控東北紅豆杉異戊二烯代謝途徑產(chǎn)物紫杉醇的生物合成[16]。從長春花(Catharanthusroseus)中篩選出的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子ORCA2(octadecanoid-derivative responsiveCatharanthusAP2-domain protein 2)在萜類吲哚生物堿的生物合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用[17],而且茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)的ORCA3(octadecanoid-derivative responsiveCatharanthusAP2-domain protein 3)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控長春堿生物合成過程中也具有重要作用[18]。煙草中煙堿的生物合成也受AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,JA可促進煙草中NtERF1、NtERF32、NtERF121基因的表達量增加,同時可影響煙草中總生物堿和煙堿含量的提高[8]。
為了明確雷公藤中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)信息和功能,本研究對雷公藤AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進行基因克隆和生物信息學(xué)分析,并通過實時熒光定量PCR方法檢測其在MeJA誘導(dǎo)處理后的雷公藤發(fā)狀根中的表達量變化,為進一步研究該基因的功能提供理論依據(jù),并為利用雷公藤中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子提高雷公藤植物細胞中次生代謝物質(zhì)的含量奠定基礎(chǔ)。
雷公藤(Tripterygiumwilfordii)采自福建泰寧,經(jīng)鑒定后移植于西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心;雷公藤發(fā)狀根保存于MS液體培養(yǎng)基中,25 ℃、120 r·min-1于黑暗條件下振蕩培養(yǎng),每30 d繼代1次[19]。選擇繼代2次生長良好的雷公藤發(fā)狀根,繼代培養(yǎng)28 d后,往培養(yǎng)發(fā)狀根中加入MeJA誘導(dǎo)子,使其終濃度為100 μmol·L-1。于誘導(dǎo)后0、1、3、6、9、12、24、48 h后取樣,液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1雷公藤發(fā)狀根RNA提取和cDNA合成取MeJA誘導(dǎo)處理不同時間點的雷公藤發(fā)狀根,在液氮中迅速研磨,依據(jù)Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書(博日生物科技有限公司,杭州)提取雷公藤發(fā)狀根總RNA,利用Nanodrop2000進行核酸含量測定以及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。利用無RNA酶的脫氧核糖核酸酶(DNase I)(TaKaRa)對所提取的RNA進行純化,去除基因組污染。利用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)將雷公藤受MeJA誘導(dǎo)3 h的發(fā)狀根RNA反轉(zhuǎn)錄為第一互補鏈DNA(cDNA),用于后續(xù)的基因克隆試驗;使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒將受MeJA誘導(dǎo)處理的雷公藤發(fā)狀根8個時間點的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于熒光定量PCR試驗。
1.2.2雷公藤AP2/ERF基因序列的克隆由于雷公藤植物目前沒有可用的基因組序列,通過對雷公藤根轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF進行篩選(SRX472292,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX472292),獲得了2個全長的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因(GAVZ01042389.1和GAVZ01016765.1)。參照GenBank中已知具有調(diào)控植物次生代謝功能的AP2/ERF蛋白序列,通過NCBI進行Blast比對分析,設(shè)計AP2/ERF基因擴增引物(表1)。以雷公藤總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行PCR擴增,按以下反應(yīng)體系對雷公藤AP2/ERF基因進行擴增:cDNA 1 μL、上游引物F (10 μmol·L-1) 1 μL、下游引物R (10 μmol·L-1) 1 μL、PrimeSTAR (TaKaRa) 12.5 μL補充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序為: 95 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸1 min,進行34個循環(huán);最后72 ℃終延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,用天根公司(北京)通用型DNA純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)酶進行加“A”反應(yīng),然后連接pMD18-T載體(TaKaRa)。轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞(TaKaRa)中,在氨芐抗性平板上進行篩選,再經(jīng)菌落PCR檢測后選擇陽性克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司測序驗證。
1.2.3雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因序列的生物信息學(xué)分析使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因開放閱讀框,用DNAMAN軟件將TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因序列翻譯成氨基酸序列。用Protparam在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan)預(yù)測雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸理化性質(zhì)。在NCBI中對TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2進行保守結(jié)構(gòu)域分析。用DNAMAN軟件對序列編碼的蛋白質(zhì)進行多重比對,用ClustalW軟件分析雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子與其他植物的AP2/ERF氨基酸序列親緣關(guān)系。用生物軟件MEGA 6.0對TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2進化系統(tǒng)進化樹的建立和分析。通過SWISS-MODEL完成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的分析。
表1 克隆和qRT-PCR引物
1.2.4雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因誘導(dǎo)表達差異分析將1.2中反轉(zhuǎn)錄cDNA用于熒光定量PCR試驗,依據(jù)TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit說明進行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系如下:cDNA模板2 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL,Rnase-Free dH2O 8.5 μL。實時PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性30 s;然后進行40個循環(huán):95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s。以26S核糖體RNA基因作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt方法分析TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2的相對表達量,其中ΔCt=Ct(樣本/對照)-Ct內(nèi)參,ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對照[20]。
以雷公藤發(fā)狀根cDNA為模板,PCR擴增克隆得到了2個AP2/ERF家族基因,分別命名為TwAP2/ERF1(GenBank登錄號GAVZ01042389.1;圖1,A)和TwAP2/ERF2(GenBank登錄號GAVZ01016765.1;圖1,B)。
TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因的開放閱讀框與氨基酸序列分析表明,TwAP2/ERF1基因含有525 bp開放閱讀框(ORF),編碼186個氨基酸(圖2);TwAP2/ERF2基因的開放閱讀框(ORF)為789 bp,編碼262個氨基酸(圖3)。
利用ProtParam軟件對TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析,TwAP2/ERF1基因預(yù)測編碼蛋白分子量大小為20.53 kD,理論等電點為8.96;帶正電殘基(Arg+Lys)為24,帶負電殘基(Asp+Glu)為22,蛋白不穩(wěn)定系數(shù)是73.28,是不穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為65.59,親水性系數(shù)為-0.676,為親水性蛋白。TwAP2/ERF2基因預(yù)測編碼蛋白分子量大小為29.30 kD,理論等電點為6.41;帶正電殘基(Arg+Lys)為19,帶負電殘基(Asp+Glu)為23,蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是49.49,是不穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為41.76,親水性系數(shù)為-0.980,為親水性蛋白。
圖1 雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因擴增M. DL2000;A. TwAP2/ERF1;B. TwAP2/ERF2Fig.1 Amplification of open read frame (ORF) of TwAP2/ERF1 and TwAP2/ERF2
ATG為起始密碼子;TAA為終止密碼子圖2 TwAP2/ERF1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列ATG is the initiation codon; TAA is the stop codonFig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of TwAP2/ERF1
ATG為起始密碼子;TAG為終止密碼子圖3 TwAP2/ERF2基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列ATG is the initiation codon; TAG is the stop codonFig.3 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of TwAP2/ERF2
NCBI中保守結(jié)構(gòu)域分析表明,TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因編碼蛋白的氨基酸序列都具有單個AP2保守結(jié)構(gòu)域,分別位于第64~122(圖4,A)和45~103(圖4,B)氨基酸上,符合ERF家族特征,是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。
SOPMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu),TwAP2/ERF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占31.72%,β-折疊占7.53%,無規(guī)則卷曲占50%,延伸鏈占10.75%;TwAP2/ERF2蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占19.85%,β-折疊占10.69%,無規(guī)則卷曲占53.44%,延伸鏈占16.03%。
利用SWISS-Model構(gòu)建雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2的三維結(jié)構(gòu),以擬南芥AtERF1晶體結(jié)構(gòu)[21](PBD ID:3gcc.1.A)為模板,TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2蛋白與擬南芥AtERF1蛋白氨基酸相似度分別為75.67%和75.38%。建模結(jié)果顯示,TwAP2/ERF1(圖5,A)和TwAP2/ERF2(圖5,B)與AtERF1的AP2結(jié)合域三級結(jié)構(gòu)非常相似,均有1個α螺旋和3個β折疊。
利用DNAMAN將TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因編碼的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其他高等植物的AP2/ERF氨基酸序列進行同源關(guān)系比較(圖6),結(jié)果顯示,各種植物AP2/ERF編碼的氨基酸序列存在較高相似性,多數(shù)都達60%以上,且在AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域中都具有一個保守的YRG和WLG元件。BlastX分析表明,TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2編碼的氨基酸序列與山黃麻AP2/ERF(POO02792.1)、榆科山黃麻AP2/ERF(PON77925.1)、擬南芥AP2/ERF(AEE27952.1)、赤豆AP2/ERF(BAT83431.1)、刺菜薊AP2/ERF(KVI01950.1)的氨基酸序列具有較高相似性,分別為73%、83%、75%、75%、72%和82%、77%、68%、74%、77%。
將TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2編碼的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其他植物的AP2/ERF氨基酸序列進行系統(tǒng)的進化樹分析,使用MEGA 6.0軟件采用鄰結(jié)法構(gòu)建了不同植物中AP2/ERF的系統(tǒng)進化樹。共選取了12條植物AP2/ERF氨基酸序列進行建樹(圖7),從進化樹中可以看出,TwAP2/ERF1與TwAP2/ERF2聚為一個大類的兩個分支,TwAP2/ERF1與油桐AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐AP2/ERF(APQ47365.1)聚為一支,TwAP2/ERF2與毛果楊A(yù)P2/ERF(XP_002304640.1)和櫻桃AP2/ERF(ALD84477.1)聚為一支。
用2-ΔΔCt法處理實時熒光定量PCR數(shù)據(jù),分析雷公藤發(fā)狀根中TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2在MeJA誘導(dǎo)后不同時間的表達水平,結(jié)果如圖8。MeJA誘導(dǎo)后TwAP2/ERF1基因的相對表達量有明顯的提高,于誘導(dǎo)后9 h達到最高值,是0 h表達量的16.77倍,后隨著誘導(dǎo)時間的延長相對表達量逐漸降低,在誘導(dǎo)48 h后表達量水平與0 h無差異。MeJA誘導(dǎo)對TwAP2/ERF2基因的表達表現(xiàn)出抑制的作用,隨著誘導(dǎo)時間的延長,相對表達量有所提高,但是表達量變化水平不大。由此可知MeJA能夠誘導(dǎo)TwAP2/ERF1基因的表達,并且短時間內(nèi)能夠抑制TwAP2/ERF2基因的表達。
圖5 TwAP2/ERF1(A)和TwAP2/ERF2(B)蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 The three-dimension structures of TwAP2/ERF1(A) and TwAP2/ERF2(B)
圖4 TwAP2/ERF1(A)和TwAP2/ERF2(B)蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domain analysis of TwAP2/ERF1(A)and TwAP2/ERF2(B)
圖6 TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2與其他物種AP2/ERF氨基酸序列多重比對Fig.6 The alignment of amino acid sequence of AP2/ERF from TwAP2/ERF1, TwAP2/ERF2 and other plants
圖中各節(jié)點處數(shù)字代表可信度圖7 TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2與其他植物氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹The numbers at the node of the figure is credibility.Fig.7 Phylogenetic tree of TwAP2/ERF1, TwAP2/ERF2 and other plant species
不同小寫字母代表0.05水平差異顯著圖8 MeJA處理雷公藤發(fā)狀根對TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2表達量的影響Different normal letters represent significant differences at 0.05 levelFig.8 Effects of MeJA elicitors on the expression of TwAP2/ERF1 and TwAP2/ERF2 genes in T. wilfordii hairy roots
雷公藤作為傳統(tǒng)的藥用植物,資源短缺和活性成分含量低等問題限制了其在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控高活性次生代謝物質(zhì)生物合成途徑相關(guān)基因以及關(guān)鍵酶基因的表達是實現(xiàn)定向、高效調(diào)節(jié)藥用植物生長及活性成分生物合成的有效手段之一。近年來轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)藥用植物發(fā)育及活性成分的生物合成的研究備受關(guān)注,轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF家族是植物最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一,不僅在藥用植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用,而且還與藥用植物的活性成分生物合成和抗逆反應(yīng)密切相關(guān)[9-18]。轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF在模式植物和重要農(nóng)作物以及一些藥用植物中的調(diào)控作用已被廣泛研究,但對于雷公藤植物中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)研究未見報道。本研究以雷公藤發(fā)狀根為材料[19],從中克隆得到了TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子,其分別編碼186個和262個氨基酸。對轉(zhuǎn)錄因子TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2保守結(jié)構(gòu)域分析表明,2個轉(zhuǎn)錄因子蛋白均含有一個典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域,其中TwAP2/ERF1典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域位于64~122氨基酸位點上,TwAP2/ERF2的AP2保守結(jié)構(gòu)域位于45~103氨基酸位點上。多重序列比對發(fā)現(xiàn)TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2的保守結(jié)構(gòu)域與山黃麻(T.orientalis)AP2/ERF(POO02792.1)等其他植物的AP2/ERF蛋白結(jié)構(gòu)域有70%以上的高度相似性。對雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子的三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),2個轉(zhuǎn)錄因子蛋白均有1個α-螺旋和3個β-折疊,與擬南芥AtERF1在AP2結(jié)合域的相似性非常高,推測AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中的β-折疊可能在識別順式元件中起重要作用,而α-螺旋可能在與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用中起作用[21]。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),雷公藤TwAP2/ERF1轉(zhuǎn)錄因子與油桐AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐AP2/ERF(APQ47365.1)聚為一支且親緣關(guān)系較高,雷公藤TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子與毛果楊A(yù)P2/ERF(XP_002304640.1)和櫻桃AP2/ERF(ALD84477.1)聚為一支且親緣關(guān)系較近,研究克隆得到的雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子在進化樹中明顯聚類為兩支,推測其可能在雷公藤中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。
在自然生長環(huán)境中植物會面臨各種不利的生物脅迫和非生物脅迫,為了克服這些不利條件,植物已形成系統(tǒng)的防御機制,涉及多種信號途徑,其中JA在各種信號分子之間起著非常重要的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn),MeJA處理青蒿后,與青蒿素合成途徑有關(guān)的關(guān)鍵酶基因的表達量都有較大變化,而變化的這些基因都含有轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF的結(jié)合位點[13]。熒光定量PCR分析表明,青蒿素AaERF1和AaERF2受MeJA誘導(dǎo)表達量變化最大,且AaERF1和AaERF2過表達載體轉(zhuǎn)化青蒿植株后青蒿素含量也有所增加[13]。在煙草中,MeJA誘導(dǎo)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子NtERF32基因能夠調(diào)控生物堿代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達,從而影響著煙堿的生物合成[8]。本研究采用MeJA處理雷公藤發(fā)狀根,熒光定量PCR方法檢測TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2基因表達情況表明,TwAP2/ERF1基因受MeJA誘導(dǎo)后表達量提高,在誘導(dǎo)后9 h時表達水平上調(diào)了16倍多;但相同誘導(dǎo)條件下,TwAP2/ERF2基因的表達則表現(xiàn)出早期抑制,隨著誘導(dǎo)時間的延長,相對表達量有所提高,誘導(dǎo)48 h后表達量上升但是變化幅度較小。由此我們初步推測TwAP2/ERF1基因可能調(diào)控雷公藤中活性次生代謝物質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達,從而提高相應(yīng)次生代謝物質(zhì)的生物合成,然而雷公藤TwAP2/ERF1轉(zhuǎn)錄因子具體調(diào)控哪類活性物質(zhì)的生物合成以及具體的調(diào)節(jié)機理有待進一步研究。
本研究首次通過雷公藤根轉(zhuǎn)錄組序列分析結(jié)合PCR方法對雷公藤TwAP2/ERF1和TwAP2/ERF2轉(zhuǎn)錄因子基因進行了克隆與生物信息學(xué)分析及表達模式的初步探索,研究結(jié)果為闡明雷公藤次生代謝物質(zhì)的生物合成調(diào)控提供基礎(chǔ),同時也為進一步利用代謝工程方法提高雷公藤次生代謝物質(zhì)的含量提供依據(jù)。