路曉青,江 念,黃志寶,馮 翔,張新欣,王文凱,*

(1.長江大學農(nóng)學院,湖北荊州 434000;2.沙洋縣長湖濕地自然保護區(qū)管理局,湖北荊門 448200;3.湖北民族學院,湖北恩施 445000)

當今社會中人們的生活質(zhì)量得到很大的提升,生活節(jié)奏開始加快,來自各方面的壓力也慢慢增大,長此以往,人們便處于焦慮與疲勞狀態(tài)。感到焦慮與疲勞雖然對人體的傷害不是立即顯現(xiàn),但是這種亞健康狀態(tài)卻是不容忽視的。植物精油作為天然香料從古至今一直在沿用,其安全性和實用性可以得到保證[1-3]。目前關(guān)于精油藥理作用的文獻報道越來越多,現(xiàn)有的研究表明，精油有潛力作為抗氧化劑、鎮(zhèn)痛劑、抑菌藥物、抗疲勞藥物應用于臨床醫(yī)學[4-6]。我國植物資源豐富,其中許多植物精油具有愉悅身心、緩解疲勞、調(diào)節(jié)情緒、提高免疫力等功能,這類植物精油可作為良好的天然香料進行開發(fā)利用[7]。

竹葉椒果為蕓香科花椒屬植物,該植物始載于《本草圖經(jīng)》,主要分布于我國西南各省。竹葉椒為湖北省特色植物之一,作為藥用植物和熏香材料由來已久,民間多用來行氣消腫、祛風散瘀、活血止痛、祛蛔、治胃痛[8-10]?，F(xiàn)代研究表明，竹葉椒的根、莖、葉、果實均可入藥,主要含精油、香豆素、木脂素和微量元素等成分,具有抗菌、抗炎、增強免疫等作用[11-12]。因此,分析竹葉椒果實精油的化學成分并對其進行功能性評價具有重要意義。

目前對竹葉椒果雖有研究,但是對其產(chǎn)生功能性的成分、特性等研究較少。本文通過提取竹葉椒果實精油,利用GC-MS分析其精油的成分,并采用熏蒸的方法進行小鼠抗疲勞、抗氧化、安眠鎮(zhèn)靜的藥理實驗,進一步評價竹葉椒果實精油的藥理功能,為開發(fā)竹葉椒果實精油保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種雄性小鼠(KM小鼠) 6周齡，健康,體重20～25 g,購于三峽大學動物實驗中心,合格證號:XSD2016110007;竹葉椒果實 產(chǎn)自湖北省恩施州宣恩縣珠山鎮(zhèn)解放街);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FA-1004B型電子天平 上海精密儀器有限公司;DFY-500型搖擺式高速萬能粉碎機、水蒸氣蒸餾裝置 天津泰斯特儀器有限公司;TDL-80-2B型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Agilent6890GC-5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;5V-1A型圣蘭德干熱揮發(fā)器 恩施州紅霞化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹葉椒果實精油的提取 參考[13-15]的方法,取鮮重10 kg的竹葉椒果實,用自來水清洗3次后，用蒸餾水清洗一次,置于通風的陰涼干燥處,自然風干至恒重。采用水蒸氣蒸餾法，在料液比1∶30 g/mL，微波輔助2.0 min,蒸餾時間100 min的條件下，提取竹葉椒果實精油,將制得的竹葉椒果實精油經(jīng)無水硫酸鈉除去多余水分,備用。

1.2.2 精油成分分析 GC條件:HP-5MS氣相毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。樣品進樣口:GC。進樣方式:手動。柱箱:平衡時間1 min,升溫條件:40 ℃保持5 min,然后3 ℃/min升高到90 ℃,保持5 min,然后8 ℃/min 升高230 ℃，保持5 min。總運行時間:49.167 min[16]。

MS條件:EI離子源;溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;電子倍增器電壓1.6 kV;質(zhì)量掃描范圍45～400 m/z[17]。

主要成分選擇標準:通過質(zhì)譜掃描后得出相應的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜譜庫檢索選擇匹配度大于90%的物質(zhì)。

1.2.3 動物分組與處理 以竹葉椒果實精油為材料,采用干熏蒸法、加強熏蒸法兩種熏香方式處理小鼠；采用低、中、高三種處理濃度分別對應處理時間為1、2、3 h(精油濃度分別為1.25、2.5、3.75 mL/m3)。

干熱熏蒸法:熏香處理中用體積0.8 m3的紙箱罩住鼠籠,采用圣蘭德干熱揮發(fā)器調(diào)整精油揮發(fā)速度,每天正常飲食,上午9點～12點對小鼠進行熏香?？刂凭蛽]發(fā)劑量為1 mL/h,研究每天熏香處理1、2、3 h對小鼠的影響,每組小鼠20只?？瞻捉M20只小鼠,不進行熏蒸處理。

加濕熏蒸法:熏香處理中用體積0.8 m3的紙箱罩住鼠籠,將3 mL精油加5 mL 80%乙醇混合,溶于1 L水中,調(diào)水至恒溫90 ℃,用霧化器調(diào)節(jié)霧化速度為0.33 L/h,研究每天熏香處理1、2、3 h對小鼠的影響,每組小鼠20只,空白組20只小鼠,不進行熏蒸處理。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 抗氧化測定 小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,每組取8只,禁食1 d,斷頭取血。血樣于4 ℃的冰箱中靜置后,在離心機中以4000 r/min離心20 min,取上清液,分別按照SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒說明書方法，測定血清中SOD活性、和GSH-Px活力與MDA含量[18]。

1.2.4.2 抗疲勞測定 游泳時間:小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,取6只讓其在恒溫水槽中進行負重游泳(游泳過程中小鼠尾部綁有體重10%的鉛絲),水槽深度50 cm,水溫(27±5) ℃。記錄從小鼠開始沉入水面下10 s后不能浮出水面的時間,此時間即為游泳力竭時間[19]。

爬桿時間:小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,取6只進行爬桿試驗,實驗前訓練30 min,將小鼠置于玻璃棒上,玻璃棒直徑1 cm,記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌下的時間[20]。

1.2.4.3 凝神效果 熏香處理小鼠后每周測一次小鼠睡眠發(fā)生率,每天15點為飼料投放時間,在投放飼料2 h內(nèi)，觀察記錄各實驗組入睡動物數(shù),小鼠翻正反射消失達1 min以上的鼠數(shù)為入睡動物數(shù),測小鼠睡眠發(fā)生率[21]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉椒果實精油中各化學成分GC-MS圖譜

采用GC-MS對竹葉椒果實精油進行分析,所得總離子流圖見圖1,鑒定其成分,通過質(zhì)譜圖面積計算含量。

2.2 竹葉椒果實精油主要成分分析結(jié)果

竹葉椒果實精油中共檢測出59種化學成分,從中鑒定出25種物質(zhì),所檢測的成分占精油總量的82.61%。由表1所示,竹葉椒果實精油中主要為醇類物質(zhì)和烯類物質(zhì);醇類物質(zhì)9種,占精油總量的39.22%;烯類物質(zhì)12種,占精油總量的36.94%;酯類物質(zhì)1種,占精油總量的1.33%;酮類物質(zhì)1種,占精油總量的0.11%;苯類物質(zhì)1種,占精油總量的1.03%。在鑒定的25種成分中,桉葉油醇(36.19%)、萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)是構(gòu)成竹葉椒果實精油的主要成分。

表1 竹葉椒果實精油主要成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results of main components in essential oil of Zanthoxylum armatum DC.

萜品烯對植物氧化性損傷具有顯著的修復作用,且單獨作用或和其他物質(zhì)協(xié)同作用均可[23]。甜橙精油中含有大量烯類物質(zhì),其中包含α蒎烯、萜品烯、3-蒈烯等,且3-蒈烯所占比例較高[24],甜橙精油具有增強小鼠運動能力、緩解小鼠抑郁癥狀的作用[25]。

陳玉等[16]研究了竹葉椒樹皮中的化學成分,主要有白屈菜紅堿、卡瑞花椒堿、4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮等11種物質(zhì),其中主要以生物堿和同類物質(zhì)為主,和本文所測成分相比可得,同種植物不同部位的化學成分相差巨大。劉建華等[26]對貴州產(chǎn)竹葉椒果實的精油中進行研究,從中分析出32個組分,烯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)為主要成分,和本文研究結(jié)果相似;但是其中β-石竹烯、α-葎草烯、L-芳樟醇、α-蒎烯含量較高,和本文存在差異,對比本文研究可知,同種植物同種部位竹葉椒，由于種植環(huán)境不同，其化學成分也不同。

2.3 竹葉椒果實精油熏香對小鼠抗氧化效果的影響

由表2～表3得出,通過30 d的處理后,兩種方法對小鼠血清中的SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量都有一定的影響,隨著劑量的加大,SOD活力和GSH-Px活力呈逐漸升高趨勢,MDA含量呈逐漸降低趨勢。

表2 干熱熏蒸法處理小鼠血清中抗氧化指標Table 2 Antioxidant indexes in serum of mice of dry heat fumigation treatment

表3 加濕熏蒸法處理小鼠血清中抗氧化指標Table 3 Antioxidant indexes in serum of mice of humidification fumigation treatment

由表2可得,干熱熏蒸法處理小鼠過程中,和對照相比，低劑量的SOD活力稍有增加,但差異不顯著(p>0.05),中劑量和高劑量組和對照相比達到顯著性差異(p<0.05);三個劑量組和對照組相比,GSH-Px活力均達到顯著性差異(p<0.05);對于小鼠血清中MDA含量，中、高劑量組和對照相比，均達到顯著性差異(p<0.05)。

由表3可得,加濕熏蒸法處理小鼠過程中,處理組和對照組相比,三個劑量組的SOD活力均達到顯著性差異(p<0.05);處理組和對照組相比,中、高劑量組的GSH-Px活力達到顯著性差異(p<0.05);處理組和對照相比,三個劑量組的MDA含量均達到顯著性差異(p<0.05)。綜上所述,兩種處理方式過程中,當0.8 m3的體積中竹葉椒果實精油劑量達到2 h時,對小鼠血清中的SOD和GSH-Px活力有顯著增加作用(p<0.05),對MDA含量有顯著降低作用(p<0.05),說明對小鼠有較強的抗氧化功效。

干熱熏蒸法和加濕熏蒸法兩種處理方式之間對比,從整體上看加濕熏蒸法的SOD、GSH-Px活力較強,MDA含量較低,且兩種處理方式最高劑量組的三個檢測指標均與對照組達到顯著性差異(p<0.05)。對比兩種處理方式,對小鼠抗氧化性效果來看,加濕熏蒸法要強于干熱熏蒸法。

2.4 竹葉椒果實精油熏香對小鼠抗疲勞效果的影響

由表4～表5得出,在處理30 d后,兩種熏香方式三種劑量均能增加小鼠負重游泳和爬桿時間,且中、高劑量組達到顯著水平(p<0.05);對于小鼠負重游泳時間的提升大于小鼠爬桿時間,在高劑量組的兩種處理方式下,小鼠負重游泳時間延長率分別達到74%、99%;兩種處理方式對比,加濕熏蒸法對抗疲勞的效果更明顯。

表4 竹葉椒果實精油熏香對小鼠游泳時間的影響Table 4 Effect of incense on swimming time of mice

表5 竹葉椒果實精油熏香對小鼠爬桿時間的影響Table 5 Effect of incense on pole climbing time of mice

2.5 竹葉椒果實精油熏香對小鼠凝神效果的影響

由表6得出,在處理1周后,干熱熏蒸法處理對小鼠睡眠發(fā)生率效果不顯著(p>0.05),加濕熏蒸法處理對睡眠發(fā)生率有一定的增效作用;在處理2周及2周以后,兩種處理方式各劑量均能提高睡眠發(fā)生率,除干熱熏蒸法低劑量處理組外，均達到顯著性差異(p<0.05);處理4周后,加濕熏蒸法高劑量處理組對小鼠睡眠發(fā)生率影響最大,睡眠發(fā)生增加率為27.5%。

表6 竹葉椒果實精油熏香處理小鼠后睡眠發(fā)生率(%)Table 6 The incidence rate of sleeping of mice after treatment of incense(%)

3 結(jié)論與討論

竹葉椒果實精油經(jīng)GC-MS鑒定出25種成分,其中主要成分有三種,分別為桉葉油醇(36.19%)、和萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)?？寡趸囼炛?竹葉椒果實精油對小鼠血清中SOD、GSH-Px均有提升作用,對MDA含量有降低作用,說明在研究的劑量范圍內(nèi),竹葉椒果實精油對小鼠有很好的抗氧化效果。抗疲勞試驗中,對小鼠負重游泳時間和爬桿時間均有增加作用,說明對小鼠抗疲勞有很好的效果。通過觀測小鼠進食后2 h內(nèi)的睡眠率可以發(fā)現(xiàn),精油熏香處理可以增加小鼠睡眠率,且隨著時間和劑量的增加效果更明顯。從處理方式來看,在試驗劑量相同的情況下，在抗氧化效果、抗疲勞程度、增進睡眠方面，加濕熏蒸法都比干熱熏蒸法效果好。在試驗范圍內(nèi)，各方面指標顯示劑量越高，效果越好，且未發(fā)現(xiàn)任何不適現(xiàn)象,竹葉椒作為一種熏香材料具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>