楊俐，李全平，陳士林，邱健健，李文佳*，向麗*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性檢測評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.廣東東陽光藥業(yè)有限公司/國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，廣東 東莞 523850)

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(Berk)Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科Hepialidae昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體[1]，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，與人參、鹿茸并列為我國“中藥三寶”[2]。冬蟲夏草始載于公元8世紀(jì)的《月王藥診》，用于治療肺部疾病，隨后歷代醫(yī)藥典籍對冬蟲夏草均有不同程度的記載[3]，收載于歷版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)，具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效?，F(xiàn)代研究表明冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等多種作用[4-5]。冬蟲夏草主要生長于海拔3500～5000 m的高山灌叢和草甸，國內(nèi)主要分布于西藏、青海、四川、云南、甘肅，國外在尼泊爾、不丹有少量分布[6-7]。近年來全球氣候變暖，雪線抬高，導(dǎo)致冬蟲夏草適宜生境面積不斷減少，加之人們過度采挖，導(dǎo)致冬蟲夏草野生資源銳減，同時對產(chǎn)區(qū)植被和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，直接或間接導(dǎo)致冬蟲夏草野生資源日漸枯竭[8]。野生冬蟲夏草已列為國家二級保護(hù)植物。

20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外有開始進(jìn)行繁育冬蟲夏草的研究，近年來，冬蟲夏草的仿生態(tài)繁育技術(shù)獲得產(chǎn)業(yè)化成功[9-10]。冬蟲夏草仿生態(tài)繁育是通過模擬冬蟲夏草生長過程與環(huán)境的關(guān)系進(jìn)行繁育，可以在室內(nèi)模擬適宜生態(tài)環(huán)境，進(jìn)行菌種繁殖、寄主昆蟲飼養(yǎng)、菌種侵染、子實(shí)體的生長發(fā)育，也可以在室內(nèi)進(jìn)行菌種擴(kuò)繁、寄主昆蟲卵和成蟲的飼養(yǎng)，然后選擇適宜生境放養(yǎng)感菌(未感菌)幼蟲，在野外完成冬蟲夏草生長過程。研究表明仿生態(tài)繁育的冬蟲夏草與野生冬蟲夏草在蟲種、菌種、形態(tài)外觀、顯微結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、有效性等方面均一致，重金屬砷的含量低，符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)及《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》有關(guān)規(guī)定[11-13]。野生冬蟲夏草由于受到產(chǎn)地環(huán)境、冬蟲夏草菌自身吸附特性及砷氧化細(xì)菌共生等影響，普遍砷含量超標(biāo)，而冬蟲夏草繁育品由于生態(tài)環(huán)境相對野生冬蟲夏草可控性高，在控制重金屬砷含量方面具有優(yōu)勢，安全性高。

無公害仿生態(tài)繁育冬蟲夏草在種質(zhì)資源選育優(yōu)質(zhì)化、繁育過程規(guī)范化、采收及產(chǎn)地初加工科學(xué)化、流通體系可溯源化、質(zhì)量控制數(shù)據(jù)化等全生命周期管控相較于野生冬蟲夏草具有顯著優(yōu)勢，也是產(chǎn)品穩(wěn)定均一、安全有效、質(zhì)量可控的重要保障。無公害仿生態(tài)繁育冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化的成功，既有利于解決資源短缺、生產(chǎn)難以為繼的問題，也利于提高冬蟲夏草的質(zhì)量、規(guī)范冬蟲夏草市場、保護(hù)高原生態(tài)環(huán)境和資源，為冬蟲夏草野生資源可持續(xù)發(fā)展提供了一條途徑，是其他瀕危珍稀中藥材仿生態(tài)繁育的典范。本文從產(chǎn)地環(huán)境要求、優(yōu)良種質(zhì)資源選育、菌種繁殖、寄主昆蟲飼養(yǎng)、菌種侵染、病蟲害綜合防治方面論述了冬蟲夏草的無公害仿生態(tài)繁育的方法，以期指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，促進(jìn)冬蟲夏草的仿生態(tài)繁育。

1 無公害冬蟲夏草產(chǎn)地環(huán)境要求

無公害冬蟲夏草生產(chǎn)的產(chǎn)地土壤必須符合GB 15618—2018農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險篩選值和管制值的使用相關(guān)要求，空氣環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB 35749—2012二類區(qū)要求，生產(chǎn)用水質(zhì)量必須符合GB 5749—2006標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。產(chǎn)地應(yīng)選生態(tài)環(huán)境條件良好的地區(qū)，產(chǎn)地區(qū)域和生產(chǎn)用水上游無或不直接受工業(yè)“三廢”、城鎮(zhèn)生活、醫(yī)療廢棄物等污染，避開公路主干線、土壤重金屬含量高的地區(qū)[14-15]。冬蟲夏草普遍存在重金屬砷含量超標(biāo)的問題，由于菌類特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對土壤中砷具有較強(qiáng)的富集作用[16]，而冬蟲夏草產(chǎn)地土壤中的砷含量普遍較高，達(dá)不到無公害農(nóng)產(chǎn)品土壤質(zhì)量要求[17]。因此在產(chǎn)地選擇上尤其要注意土壤砷含量，要求達(dá)到無公害農(nóng)產(chǎn)品土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中土壤質(zhì)量要求。

冬蟲夏草對環(huán)境選擇性極強(qiáng)，青藏高原特定的氣候條件和地理因素對其藥效和品質(zhì)的形成有關(guān)鍵作用[9]。冬蟲夏草按產(chǎn)地不同可分為藏草(主要產(chǎn)于青海、西藏)、川草(主要產(chǎn)于四川)和滇草(主要產(chǎn)于云南)。產(chǎn)地的溫度、光照、水分、土壤、地形等對蟲體和菌生長發(fā)育有極大的影響，適宜環(huán)境因子見表1。冬蟲夏草適宜生長區(qū)域環(huán)境年均溫-5.5～4.2 ℃，年均降水量409～756 mm，年均相對濕度39.7%～46.9%，年均日照141.9～157.1 W·m-2[18]。土壤環(huán)境顯著影響蝙蝠蛾幼蟲的生長發(fā)育和活動、種群數(shù)量、冬蟲夏草菌核及子座的形成。冬蟲夏草適宜土壤類型有高寒的高原草甸土、山地草甸土和高山草甸土，以高原草甸土較多，土壤要求腐殖質(zhì)豐富、有機(jī)質(zhì)含量高、土層深厚，以石頭或粉狀小塊及碎屑結(jié)構(gòu)為宜，孔隙性好，質(zhì)地疏松的砂壤土或輕壤土[19]。土壤表面應(yīng)有較密集的草根盤結(jié)層，能保護(hù)土層不受侵害。土層15～25 cm深處，含水量應(yīng)達(dá)40%～50%，有機(jī)質(zhì)含量應(yīng)在15%左右，土壤pH應(yīng)在5.0～6.5。這類土壤對寄主幼蟲入土覓食、保溫保濕、棲身防敵、老熟幼蟲化蛹、成蟲羽化等生長發(fā)育過程有重要作用。地形以海拔3000～5000 m的向陽背風(fēng)的山坡或隆起的小山脊較好，有茂密草地或間有稀疏灌叢的草地，含高山草甸植被和亞高山草甸植被，群落植物種類應(yīng)以蓼科、禾本科、莎草科、毛茛科為建群種，蓼科中的珠芽蓼、圓穗蓼的蓋度最好達(dá)50%以上，此外薔薇科、龍膽科、百合科等植物也可占一定的比例，這些草本植物可滿足寄主幼蟲不同生長發(fā)育階段所需多種營養(yǎng)成分的需要。

表1 冬蟲夏草適宜產(chǎn)地環(huán)境條件

2 冬蟲夏草優(yōu)良種質(zhì)選擇

2.1 優(yōu)質(zhì)菌種選育

《中國藥典》2015年版規(guī)定的冬蟲夏草菌種為冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(Berk)Sacc.，但在最新的分類系統(tǒng)中冬蟲夏草菌屬于子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目線性蟲草科Ophiocordycipitaceae線性蟲草屬Ophiocordyceps，Ophiocordycepssinensis[20]。仿生態(tài)繁育中首要的是篩選出侵染寄主昆蟲后能長出子實(shí)體的菌株。幾十年以來，研究人員從各個產(chǎn)地采集的冬蟲夏草中分離出的真菌涉及10個屬30多種，如蝙蝠蛾擬青霉、中國擬青霉、蝙蝠蛾被孢霉、蟲草頭孢霉、中國被毛孢、中國彎頸霉、中國金孢霉等(見表2)?，F(xiàn)代研究證明冬蟲夏草的無性型為中國被毛孢，是仿生態(tài)繁育實(shí)際生產(chǎn)用菌種的主要來源，其菌絲白色，菌苔灰白色，菌落呈茸狀、圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲體有鮮香菇氣味[21]。優(yōu)質(zhì)菌種生長迅速，能降低病蟲害感染率，降低管理難度，提高侵染率和成草率，宜選擇健康、健壯、具備產(chǎn)生子座能力的中國被毛孢作為侵染菌株[22]。

2.2 優(yōu)質(zhì)蟲種選育

表2 冬蟲夏草無性型研究匯總

冬蟲夏草寄主昆蟲具有豐富的種質(zhì)資源，其寄主昆蟲主要為鱗翅目Lepidoptera有喙亞目Glossata外孔次目Exoporia蝙蝠蛾總科Hepialoidae昆蟲[10]。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)了60余種冬蟲夏草寄主昆蟲，僅限于蝙蝠蛾科，包括蝠蛾屬、擬蝠蛾屬、無鉤蝠蛾屬、鉤蝠蛾屬，以鉤蝠蛾屬、無鉤蝠蛾屬居多[19]。寄主昆蟲有區(qū)域分布和垂直分布的規(guī)律，不同地區(qū)、不同海拔、甚至同一山脈不同的坡向都可以形成不同種類。除蟲草鉤蝠蛾為廣域分布種，在西藏、青海、四川、云南、甘肅均有分布，其余種類分布狹窄，各產(chǎn)區(qū)寄主昆蟲種類見表3。寄主昆蟲的品種不同，其飼養(yǎng)難度、冬蟲夏草形成率和品質(zhì)差異較大，仿生態(tài)繁育另一首要任務(wù)便是要選出適宜冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化繁育的寄主種質(zhì)資源，然后對表現(xiàn)優(yōu)異的蟲種通過遺傳育種學(xué)的理論和技術(shù)，篩選出優(yōu)良的寄主昆蟲[23]。優(yōu)質(zhì)蟲種應(yīng)該具有不退化、繁殖快、易被中國被毛孢侵染、出草率高且品質(zhì)好的特征[13]。目前發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草優(yōu)勢寄主有：西藏產(chǎn)地鉤蝠蛾，青海產(chǎn)地玉樹無鉤蝠蛾，四川產(chǎn)地貢嘎鉤蝠蛾、小金蝠蛾、斜脈蝠蛾，云南產(chǎn)地白馬鉤蝠蛾、人支鉤蝠蛾、德欽鉤蝠蛾和玉龍無鉤蝠蛾，甘肅產(chǎn)地門源無鉤蝠蛾、玉樹無鉤蝠蛾[24-26]。

3 無公害冬蟲夏草繁育方法

3.1 冬蟲夏草菌種擴(kuò)繁

3.1.1菌種分離純化 冬蟲夏草菌可用組織分離方法從冬蟲夏草子座和蟲體內(nèi)分離得到，也可用子囊孢子分離法獲得子囊孢子。組織分離法要選取新鮮、完整及子座飽滿的冬蟲夏草，將冬蟲夏草蟲體外的菌膜與土粒剝?nèi)?，用毛刷洗凈表面泥土，以流水沖洗干凈，在無菌條件下用75%乙醇進(jìn)行表面消毒后，以無菌手術(shù)刀削去蟲體和子座的表皮，將其切成小塊，在切蟲體時注意不能碰到昆蟲腸道，然后將組織小塊接種于培養(yǎng)基上[27]。組織分離法比較簡單，成功率也比較高，一般在80% 以上。子囊孢子分離法一般選擇新鮮、子座可孕膨大、子囊殼清晰的冬蟲夏草，可以在箱內(nèi)套袋采集或自制玻璃采集器，將采集的子囊孢子浸泡在1∶10的土壤浸出液中，在1000 r·min-1離心機(jī)上離心10 min，依次用10%、20%的蔗糖溶液分別洗滌后離心2次，再用50%蔗糖溶液離心3 min，棄上清液后，采集浮于液面的子囊孢子，在無菌條件下接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，直至長出單個菌落[28]。子囊孢子分離法比較復(fù)雜，分離的子囊孢子要注意保持活性。

3.1.2 冬蟲夏草菌培養(yǎng) 采用固體試管斜面，或三角瓶裝固體培養(yǎng)基或培養(yǎng)料消毒滅菌后，將分離純化的冬蟲夏草菌接種在培養(yǎng)基上，在12～20 ℃下培養(yǎng)。在搖瓶內(nèi)裝入營養(yǎng)液，將培養(yǎng)好的母種接入瓶內(nèi)，通過振蕩使瓶中的氧氣含量增加，液態(tài)培養(yǎng)基便于菌體充分接觸和吸收營養(yǎng)，生長和繁殖加快。液體菌種產(chǎn)孢后可直接用于培植冬蟲夏草，也可用發(fā)酵罐進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖。冬蟲夏草菌生長的溫度控制在12～20 ℃，20 ℃菌絲生長快，當(dāng)溫度高于25 ℃，菌絲不再生長。冬蟲夏草培養(yǎng)基成分可以有多種，主要以葡萄糖為碳源、以蛋白胨為氮源。同時需要添加適量的酵母提取物、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、微量元素，可以促進(jìn)菌絲生長。液體培養(yǎng)最適的pH范圍為5～6，搖床適宜轉(zhuǎn)速為100～200 r·min-1[19]。

表3 冬蟲夏草寄主昆蟲種類

注：*冬蟲夏草優(yōu)勢寄主昆蟲。

3.2 寄主昆蟲室內(nèi)繁殖

3.2.1 飼料選擇及飼養(yǎng)條件 光照、溫度、濕度、土壤等環(huán)境因子以及飼料的種類和投放量對寄主昆蟲的生長發(fā)育有極大的影響。不同寄主昆蟲對溫度與濕度的需求不同。飼養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲過程中模擬高山草甸環(huán)境很重要，寄主昆蟲的飼養(yǎng)溫度一般在8～20 ℃，溫度過高過低都不利于生長[19]。飼養(yǎng)土壤以有機(jī)質(zhì)含量多的腐殖土為宜，研究建議幼蟲飼養(yǎng)的前期和中期土壤可用腐殖土和沙土混合作為基質(zhì)，后期用純沙土，土壤含水量控制在40%～60%。飼料是飼養(yǎng)寄主昆蟲過程中的重要因素，飼料的營養(yǎng)和品質(zhì)決定幼蟲的體質(zhì)和抗病能力。天然飼料主要來自19科35屬的植物根莖部分，如莎草科Cyperaceae、寥科Polygonaceae、禾本科Gramineae、龍膽科Gentianaceae等，其中圓穗蓼、珠芽蓼、小大黃、蘋果、胡蘿卜、馬鈴薯等植物最受喜愛[29]，初孵幼齡蟲要投喂幼嫩新鮮的食物。人工飼料應(yīng)該具有豐富的營養(yǎng)，能提供生長發(fā)育各階段所需要的營養(yǎng)元素，幼蟲飼料應(yīng)具有高糖、高灰分、高鉀 、多種氨基酸[9，30]。

3.2.2 蝠蛾幼蟲的世代循環(huán)養(yǎng)殖 冬蟲夏草寄主蝠蛾為完全變態(tài)昆蟲，眾多寄主蝠蛾雖然種類不同，但生物學(xué)特性差異不大，經(jīng)歷一個世代的蟲態(tài)和時間差不多。在原產(chǎn)地的自然條件下，寄主蝠蛾一個完整的生活周期包括卵、幼蟲、蛹和成蟲，幼蟲期最長，且世代重疊[10]。養(yǎng)蟲室應(yīng)在干凈、安靜、無污染地方建立，由緩沖間、消毒室、操作間、幼蟲室、成蟲室、蛹室組成[31]。成蟲羽化后雌雄成蟲按1∶2.5的比例捕捉置容器中交配、產(chǎn)卵，成蟲不需要補(bǔ)充營養(yǎng)，不必投喂食物，只要保持環(huán)境中的水分和溫度適宜，雌雄蛾即能正常存活和交尾產(chǎn)卵。卵產(chǎn)出后應(yīng)及時收集，用滅菌水洗凈表面的雜質(zhì)，平鋪放置在濕潤的濾紙、土壤等保濕基質(zhì)上孵化，在無菌黑暗條件下，控制溫度在15～18 ℃，空氣相對濕度70%～80%。卵的孵化期約1個月，可在孵化的第25天加入消毒處理的飼料[32]。幼蟲習(xí)性是在土中建筑巢穴生活，取食植物根莖，土壤要求疏松、保濕、透氣性良好的高山草甸土和亞高山草甸土，飼料最好采用蓼科植物珠芽蓼、圓穗蓼根莖，也可以用禾本科、莎草科的嫩根飼養(yǎng)，在低海拔地區(qū)還可以用胡蘿卜、紅薯、蘋果等人工飼料飼養(yǎng)。溫度宜控制在12～20 ℃，空氣相對濕度70%～85%，土壤含水量40%～50%，加水應(yīng)采取噴霧或少量滴加的方法。幼蟲期長達(dá)6齡，是病蟲害致死最嚴(yán)重的時期，要注意保持無菌環(huán)境。飼養(yǎng)一段時間后應(yīng)當(dāng)及時添加新的飼料，將新鮮飼料直接放置在原有土壤飼料的上面。若幼蟲排泄的糞便多，雜菌滋生，環(huán)境惡化，應(yīng)當(dāng)及時整體更換。輕輕翻倒養(yǎng)蟲容器，倒出其中的土壤、幼蟲及飼料，然后用鑷子將幼蟲輕輕從中取出，放入裝好新的土壤飼料的養(yǎng)蟲容器中。幼蟲體壁柔軟嬌嫩，飼養(yǎng)時除了必要的觀察、換土和飼料外，應(yīng)盡量減少翻動，避免人為造成損傷，土壤必須經(jīng)過篩檢除去粗硬雜質(zhì)石礫，以免擦傷蟲體引致病害[22]。蛹在土穴中生活，先將土壤壓實(shí)，然后用比蛹體稍粗的工具人工造土穴，土穴略斜，深約2～3 cm，每穴放1個蛹，蛹頭向上，穴口用細(xì)土掩蓋。蛹期控制相對濕度80%～85%，土壤含水量40%～50%，溫度12～22 ℃。

3.3 菌種侵染寄主昆蟲

菌種侵染寄主昆蟲是保證仿生態(tài)繁育冬蟲夏草成功的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。冬蟲夏草菌與寄主昆蟲之間存在著協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，不同產(chǎn)地的菌種對應(yīng)不同的蝙蝠蛾幼蟲有不同的侵染率，一般同一或相近產(chǎn)地的菌種和蟲種之間的侵染率比較高[13，33]。在野生自然環(huán)境下，蝙蝠蛾幼蟲的侵染率極低，仿生態(tài)繁育冬蟲夏草中，所采用的侵染方式不一。主要的侵染途徑有通過昆蟲體壁或表皮、口器或氣孔等自然孔口或腸道等消化道侵染，但具體到每一種蟲生真菌，各自都有自己主要的侵入特征[34]。根據(jù)主要的侵染途徑分別發(fā)明了針刺、拌入飼料喂食、表皮涂抹、浸泡及噴霧等接種方法，都有較好的效果[10]。接種宜選擇寄主昆蟲抗菌力薄弱的蛻皮期和幼蟲取食活動旺盛摩擦損傷較大的時期，結(jié)合理想的侵染工藝進(jìn)行。

3.4 冬蟲夏草無公害仿生態(tài)繁育管理技術(shù)

3.4.1 冬蟲夏草室內(nèi)仿生態(tài)繁育 室內(nèi)仿生態(tài)繁育是將從高原草甸收集到的蝙蝠蛾卵及冬蟲夏草菌在完全模擬高原地帶氣候環(huán)境的仿生態(tài)繁育氣候室內(nèi)進(jìn)行選育及繁殖，歷經(jīng)幼蟲生長、菌種擴(kuò)繁、侵染、菌核形成及子座生長等過程進(jìn)而繁育出冬蟲夏草。廣東東陽光有限公司冬蟲夏草繁育與產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)研究室經(jīng)過十余年的研發(fā)，創(chuàng)建了無公害冬蟲夏草仿生態(tài)繁育技術(shù)體系，打造數(shù)十萬平方米的仿生態(tài)繁育氣候室。幼蟲生長、菌種擴(kuò)繁參考3.1、3.2的方法，菌種侵染主要是噴霧接種或撒播接種，當(dāng)幼蟲僵化后，取出幼蟲集中在專用容器中培植。僵蟲頭部朝上種植在土壤內(nèi)，距離土表面深度不超過2～3 cm。此時子實(shí)體的發(fā)育極為關(guān)鍵，應(yīng)控制好溫度、濕度、土壤pH值以及光照。氣溫控制在10～20 ℃，空氣相對濕度70%～85%，土壤含水量40%～50%，pH 5.0～5.5；每天給以適當(dāng)?shù)纳⑸涔庹誟10]。室內(nèi)仿生態(tài)繁育通過選擇砷含量低的土壤，同時加強(qiáng)飼料及土壤理化性質(zhì)的檢測、環(huán)境的潔凈管理，保障繁育出的冬蟲夏草重金屬及砷含量不超標(biāo)，是有效解決冬蟲夏草砷含量超標(biāo)問題的主要措施。

3.4.2 冬蟲夏草半野生繁育 半野生繁育冬蟲夏草是菌種擴(kuò)繁、寄主昆蟲的卵、成蟲階段在室內(nèi)控制條件下完成，然后將感菌(未感菌)的寄主幼蟲放回冬蟲夏草適宜產(chǎn)地，完成冬蟲夏草生長形成階段。半野生繁育選地應(yīng)符合冬蟲夏草適宜產(chǎn)地環(huán)境要求，主要是在高海拔地區(qū)進(jìn)行，充分利用高原生態(tài)環(huán)境的溫度、濕度、氣壓等條件，有利于提高單位面積產(chǎn)量和降低培育的成本。寄主昆蟲放養(yǎng)入土是半野生培植的關(guān)鍵之一，放養(yǎng)數(shù)量視草場食料植物多少而定，飼料充足可適當(dāng)增加，反之也可適當(dāng)減少。蟲口密度適度，數(shù)量過多幼蟲相互爭奪生存空間易導(dǎo)致死亡，過少又會造成土地的浪費(fèi)，在同一地塊內(nèi)每年投放幼蟲，一個生活周期后，可持續(xù)產(chǎn)出冬蟲夏草。放養(yǎng)卵可采用疏松濕潤的腐殖質(zhì)或疏松濕潤的高山草甸土將卵均勻分散，按70～80?！-2撒播在草地上，幼蟲孵出后自行爬行入土覓食生活。放養(yǎng)幼蟲宜選初孵幼蟲或飼養(yǎng)至1～2齡的小幼蟲放養(yǎng)入土，若蟲齡過長、蟲體過大會增加入土困難，在入土過程中容易被草根、土塊、石礫擦傷造成死亡，一般情況幼蟲以50～60頭·m-2為宜。以撒播法接種。培植地應(yīng)根據(jù)山勢坡向開溝排水，防止積水或灌淹。投放卵或幼蟲時及投入后的1周內(nèi)，要灑水或人工遮陰，以保持土壤呈濕潤狀態(tài)且避免陽光直射，以防造成卵或幼蟲脫水死亡。為避免造成傷亡，對投放寄主昆蟲的地塊應(yīng)采取保護(hù)措施，禁止放牧，禁止人畜踐踏，防止鳥類啄食。

相對來講，由于受到自然條件的不確定性影響，傳統(tǒng)的半野生繁育方式不穩(wěn)定；生產(chǎn)的冬蟲夏草品質(zhì)參差不齊，且產(chǎn)量也不穩(wěn)定；而通過模擬高原生態(tài)環(huán)境進(jìn)行冬蟲夏草的室內(nèi)繁育過程可控，產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量均能達(dá)到要求，具有較大的優(yōu)勢[13]。目前廣東東陽光有限公司成功實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化的冬蟲夏草室內(nèi)仿生態(tài)繁育，繁育的冬蟲夏草通過湖北省《無公害農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地》及農(nóng)業(yè)部《無公害農(nóng)產(chǎn)品》認(rèn)證，并隨著科技進(jìn)步，不斷向?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)操作機(jī)械化、生產(chǎn)環(huán)境調(diào)控智能化努力，使冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化繁育朝高效優(yōu)質(zhì)、現(xiàn)代化管理的先進(jìn)生產(chǎn)方式發(fā)展。

4 冬蟲夏草無公害病蟲害綜合防治

冬蟲夏草仿生態(tài)繁育過程病蟲害較多，現(xiàn)已知的多達(dá)20余種。病蟲害主要集中在寄主昆蟲上，包括真菌、細(xì)菌、線蟲、寄生昆蟲、天敵捕食以及機(jī)械損傷，其中以感染病菌致死率最高，寄生昆蟲和線蟲等發(fā)生較少，室內(nèi)養(yǎng)殖一般無天敵(見表4)。機(jī)械損傷較為常見，雖然不會造成直接死亡，但傷口易感染病菌，造成寄主昆蟲死亡。

病害分真菌病害和細(xì)菌病害。常見的病原真菌有擬青霉、綠僵菌、白僵菌、紅僵菌等[35]。病害目前仍無有效、安全的防治藥劑，以預(yù)防為主，綜合防治，提倡無公害飼養(yǎng)，主要應(yīng)控制人工飼養(yǎng)蝠蛾環(huán)境中的微生物[19，36]。對室內(nèi)環(huán)境全面消毒，蟲室應(yīng)進(jìn)行熏蒸消毒。水、飼料等物質(zhì)進(jìn)入蟲室時先消毒滅菌，水使用無菌蒸餾水，基質(zhì)(腐殖土)先暴曬，再進(jìn)行常規(guī)高溫高壓滅菌后方可進(jìn)入蟲室，養(yǎng)蟲用的器材、容器也要定期消毒，減少病原菌及寄生蟲進(jìn)入飼養(yǎng)環(huán)境。消毒可利用臭氧、微波、高溫高壓、紫外照射等方式，藥劑使用應(yīng)符合NY/T 393—2013 綠色食品農(nóng)藥使用準(zhǔn)則，禁止使用有毒有害藥劑。保證飼料供給，增強(qiáng)蟲體抗病性，隨時檢查，及時發(fā)現(xiàn)和剔除病、死蟲體以防止病害傳播。積極篩選抗病性高的種群，提倡雜交，防止種群退化。除此以外，養(yǎng)殖人員也應(yīng)注意個人衛(wèi)生，做好消毒工作，進(jìn)入工作室更換經(jīng)消毒處理的實(shí)驗(yàn)服，防止交叉污染。

蟲害有螨蟲、線蟲、蚊蟲、寄生蠅、寄生蜂等，線蟲所占比例少，寄生性蟲害極少發(fā)生。冬蟲夏草采收后徹底清除表面雜質(zhì)泥沙，以去除寄居在表面的螨(卵)；加工使藥材含水量降低到15%以下，使所帶螨(卵)死亡；儲藏過程中保持環(huán)境的干燥清潔，避免螨蟲的進(jìn)入和生長繁殖。藥材用包裝袋密封包裝，有條件最好采用充氣包裝，可避免螨蟲的為害。

表4 冬蟲夏草主要病蟲害及特征

5 無公害冬蟲夏草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

無公害冬蟲夏草是指農(nóng)藥、重金屬及有害元素等多種對人體有毒物質(zhì)的殘留量均在限定范圍以內(nèi)的冬蟲夏草。無公害質(zhì)量指標(biāo)包括藥材的真?zhèn)?、農(nóng)藥殘留和重金屬及有害元素限量、有效成分含量等?！吨袊幍洹?015版規(guī)定冬蟲夏草干燥品腺苷含量不得少于0.010%。冬蟲夏草含有一定量的重金屬，無公害冬蟲夏草中重金屬含量應(yīng)該符合《中國藥典》2015年版規(guī)定，重金屬殘留量鉛≤1.0 mg·kg-1，鎘≤0.5 mg·kg-1，砷≤2.0 mg·kg-1，汞≤0.1 mg·kg-1，銅≤20 mg·kg-1。野生冬蟲夏草鉛、鎘、銅等含量一般符合標(biāo)準(zhǔn)，部分產(chǎn)地汞含量有超標(biāo)，而總砷大部分高于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)[17，37]。冬蟲夏草砷含量超標(biāo)是人們質(zhì)疑的關(guān)鍵點(diǎn)，2016年因其砷含量超標(biāo)，國家食品藥品監(jiān)督管理局取消其用作保健品的資格。但多數(shù)研究結(jié)果表明，植物中砷含量及形態(tài)跟動物、菌類不同，植物類藥材中砷主要以無機(jī)形態(tài)存在，因而毒性較高，冬蟲夏草雖然總砷含量高，但主要以無毒的有機(jī)砷形式存在[38]，無機(jī)砷不超標(biāo)[39-41]。臺灣地區(qū)2016年10月1日起對冬蟲夏草藥材砷含量已不做限量規(guī)定[40]。但其總砷含量高的現(xiàn)狀也不可忽略。其總砷含量高主要是由于產(chǎn)地土壤砷含量較高，冬蟲夏草菌自身對砷有一定的富集作用，同時共生的砷氧化細(xì)菌有一定的促進(jìn)作用，因此要尤其注意仿生態(tài)繁育的土壤砷含量，必須符合無公害農(nóng)產(chǎn)品土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時還要加強(qiáng)生長和生產(chǎn)過程中的各項(xiàng)管控，限制砷的其他來源。廣東東陽光有限公司仿生態(tài)繁育的冬蟲夏草重金屬及砷含量符合《中國藥典》及《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》有關(guān)規(guī)定，通過了農(nóng)業(yè)部《無公害農(nóng)產(chǎn)品》認(rèn)證。此外要加強(qiáng)冬蟲夏草中無機(jī)砷的研究，對其所帶來的健康風(fēng)險能夠有更精準(zhǔn)的分析，制定適宜的標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲夏草價格昂貴、資源緊缺，常出現(xiàn)以假亂真、以次充好的現(xiàn)象，市場上常見的混淆品有亞香棒蟲草、涼山蟲草、香棒蟲草、分支蟲草、新疆蟲草、蛹蟲草、闊孢蟲草等，偽品一般以其他材料冒充冬蟲夏草蟲體或子座，經(jīng)過人工模壓和染色等手段造假，也有添加金屬粉等增重或美化外觀等[42]。針對市場上冬蟲夏草混偽品，通過性狀、顯微、理化與DNA分子鑒定等方法可鑒別[43-44]。

6 展望

近年來，冬蟲夏草的繁育取得了重大突破，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，且冬蟲夏草繁育品不存在重金屬超標(biāo)的問題，也能滿足藥效要求，可極大緩解野生冬蟲夏草資源短缺及砷超標(biāo)的問題。當(dāng)然開展冬蟲夏草繁育也有很多需要深入研究的領(lǐng)域，如寄主昆蟲種質(zhì)資源十分豐富，需繼續(xù)深入研究優(yōu)質(zhì)蟲種選育工作；一些冬蟲夏草重金屬含量超標(biāo)，假冒偽劣產(chǎn)品充斥市場，急需制定相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范市場；一些病蟲害沒有較好的防治方法，主要還是以預(yù)防為主，還需深入研究發(fā)生規(guī)律、綜合防治技術(shù)等。針對種種問題，應(yīng)加大科研力度，致力于解決生產(chǎn)實(shí)際問題，并大力推廣無公害冬蟲夏草仿生態(tài)繁育技術(shù)，穩(wěn)定和提高冬蟲夏草產(chǎn)量和質(zhì)量，推動冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展。