胡亞平，王錦，鄭麗，田新利，代玲，林玲輝，王立安

(1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北 邢臺(tái) 054000；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

硫磺菌(Laetiporussulphureus)又名黃芝、硫磺多孔菌、硫色多孔菌，獨(dú)立或者呈簇生長于腐爛的落葉或針葉樹種的原木、樹樁和樹干上，是一種有重要利用價(jià)值的食用兼藥用真菌，廣泛分布于歐洲、亞洲和北美洲的美國[1]。張津等優(yōu)化了從硫磺菌子實(shí)體中提取水溶性多糖的提取工藝[2]；Lung M Y.從硫磺菌菌絲體和發(fā)酵液中分別提取胞內(nèi)多糖和胞外多糖，發(fā)現(xiàn)它們均具有一定的抗氧化活性[3]；閆梅霞等發(fā)現(xiàn)硫磺菌菌絲體粗多糖對(duì)小鼠Lewis肺癌具有一定的體內(nèi)抑制作用，最大抑制作用達(dá)到了35.7%[4]；王娟等發(fā)現(xiàn)硫磺菌搖瓶發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)8種植物病原菌、1種霉菌、7種細(xì)菌都有較為顯著的抗菌作用[5]。目前對(duì)于硫磺菌多糖的研究相對(duì)較少，特別是關(guān)于硫磺菌多糖的純化和結(jié)構(gòu)的研究還鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期已完成了硫磺菌野生菌種的馴化。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室培育的硫磺菌子實(shí)體為材料提取粗多糖，進(jìn)行分離純化，并對(duì)純化后的多糖進(jìn)行了理化特性的研究，以及體外抗氧化活性和抗腫瘤活性的初步探究，以期為硫磺菌多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫磺菌子實(shí)體，由河北師范大學(xué)真菌生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室種植；人胃癌BGC823細(xì)胞株，保存于河北師范大學(xué)真菌生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，液氮凍存，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、順鉑(DDP)，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基，浙江天杭生物科技公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水，其余所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

VERTEX 70傅立葉變換紅外-拉曼-紅外顯微鏡聯(lián)用光譜儀，德國布魯克；S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立；BioLogicLP 色譜系統(tǒng)，Bio-RAD公司；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，Thermo美國。

1.3 硫磺菌多糖的制備及分離純化

1.3.1 粗多糖的制備 新鮮硫磺菌子實(shí)體，烘干機(jī)干燥，粉碎后得到硫磺菌子實(shí)體干粉，稱重得質(zhì)量m1，向其中加蒸餾水加熱浸提三次(液料比20 mL·g-1，80 ℃，4 h)，真空抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃濃縮，將得到的濃縮液采用Sevage法除蛋白[6]，棄掉有機(jī)相和蛋白層，得到水相層，重復(fù)脫蛋白操作直至無蛋白層析出。向收集的水相層加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置醇沉過夜，4 000 r·min-1離心20 min，真空冷凍干燥，得到硫磺菌粗多糖(LSPS)，稱重得質(zhì)量m2。按公式(1)計(jì)算LSPS得率。

LSPS得率(%)=m2/m1×100%

(1)

1.3.2 DEAE-52柱色譜 取硫磺菌粗多糖150 mg溶于10 mL蒸餾水中，配成15 mg·mL-1的多糖水溶液，進(jìn)行DEAE-52離子交換柱色譜，所用色譜柱規(guī)格為1.5 cm×23 cm。以0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol·L-1的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，控制流速為2.5 mL·min-1，以4 mL/管收集洗脫液，使用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖顯色，并在 490 nm下測量其吸光度，直到無多糖組分流出，共收集60管。以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線圖，合并洗脫峰部分，60 ℃濃縮，-20 ℃真空冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 掃描電鏡觀察

取適量凍干的多糖樣品粉末，通過雙面膠粘在樣品臺(tái)上，清除多余的不能被粘附在樣品臺(tái)上的粉末，使得樣品臺(tái)上只保留一層薄薄的待測樣品。噴鍍金原子，用掃描電子顯微鏡觀察樣品表面并拍照。

1.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖含量的測定

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚硫酸法，參考文獻(xiàn)方法[7]稍做改動(dòng)。用蒸餾水配制10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取10只100 mL容量瓶，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，定容至刻度。各取2 mL樣品放入試管內(nèi)，分別加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，混勻。冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀于490 nm處測吸光度值，以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量(μg·mL-1，X)為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=aX+b。

1.5.2 多糖含量的測定 用蒸餾水配制一定濃度的多糖溶液，濃度為w(μg·mL-1)，取1 mL的多糖溶液用上述的硫酸苯酚法檢測，得到吸光度值A(chǔ)1。按公式(2)計(jì)算多糖含量。

多糖含量(%)=(A1-a)/wb×100%

(2)

式中：A1為用苯酚硫酸法測定的吸光度值；a、b 為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中的系數(shù)值；w 為多糖溶液濃度(μg·mL-1)。

1.6 紅外光譜掃描

取2 mg 左右干燥的多糖樣品，與 300 mg左右KBr粉末，紅外燈下在瑪瑙研缽中輕輕研勻壓片，進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍4000～400 cm-1。

1.7 氫譜分析

取多糖10 mg左右，溶于0.5 mL重水(D2O)中，用600 MHz核磁共振儀測定。

1.8 體外抗氧化、抗腫瘤活性測定

1.8.1 抗氧化活性 采用DPPH自由基(DPPH·)清除能力的測定法，參考文獻(xiàn)方法[8]稍做改動(dòng)。用無水乙醇配制0.2 mol·L-1DPPH·工作液，將待測多糖配成不同濃度的樣品液，以同一濃度BHT為陽性對(duì)照，依次向96孔板中加入100 μL不同濃度的樣品液，100 μL的DPPH工作液，室溫下暗反應(yīng)震蕩30 min，酶標(biāo)儀測定517 nm處的吸光度值A(chǔ)。按公式(3)計(jì)算DPPH·清除率。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(3)

式中：Ai為100 μL DPPH·工作液+100 μL 樣品液的OD517；Aj為100 μL 無水乙醇+100 μL 樣品液的OD517；A0為100 μL DPPH·工作液+100 μL 蒸餾水的OD517。

1.8.2抗腫瘤活性 采用MTT 法，參考文獻(xiàn)方法[9]稍做改動(dòng)。用RPMI 1640將待測多糖配成不同濃度的多糖樣品液，以同一濃度順鉑為陽性對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長期的BGC 胃癌細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL，于二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2，37 ℃)培養(yǎng)24 h 后，加入100 μL多糖樣品液，陰性對(duì)照組中加100 μL的無血清培養(yǎng)基，并設(shè)空白孔。培養(yǎng)48 h后，離心棄去上清，每孔加100 μL MTT(1 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心(2 000 r·min-1，10 min)棄上清，每孔加二甲基亞砜 150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm 的吸光度值A(chǔ)。按公式(4)計(jì)算癌細(xì)胞增殖抑制率。

癌細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-As/A0)×100%

(4)

式中：As為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；A0為空白對(duì)照組吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，數(shù)據(jù)分析采用originpro 7.5、 MestReNova軟件和IC50軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的制備及分離純化

從40 g硫磺菌子實(shí)體干粉中得到的硫磺菌粗多糖(LSPS)為2.82 g，計(jì)算得粗多糖得率為7.05%。

采用DEAE-52離子交換柱對(duì)LSPS 150 mg進(jìn)行分離純化，梯度洗脫曲線如圖1所示。用水和不同濃度的NaCl溶液洗脫，共得到三個(gè)洗脫峰，合并各洗脫峰組分，分別對(duì)其減壓濃縮，冷凍干燥后共收集得到3個(gè)純化后的多糖組分，分別命名為LSPS-Ⅰ、LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ，其中LSPS-Ⅰ為水洗脫得到，共獲得36 mg；LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ分別為0.1 mol·L-1NaCl和0.3 mol·L-1NaCl洗脫得到，分別獲得24 mg和4 mg。計(jì)算得LSPS-Ⅰ、LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ的得率分別為24%、16%和2.7%。因?yàn)長SPS-Ⅲ含量太少后續(xù)未對(duì)其做進(jìn)一步研究，僅對(duì)LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ進(jìn)行了研究。

圖1 硫磺菌粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱的梯度洗脫曲線

2.2 物理性狀和掃描電鏡觀察

圖2是LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的電子顯微鏡掃描結(jié)果，給出了多糖樣品的表面結(jié)構(gòu)特征。

冷凍干燥后的多糖組分LSPS-Ⅰ呈現(xiàn)白色透明冰晶狀，1萬倍放大后在掃描電鏡下形態(tài)如圖2 A 所示，呈透明玻璃狀，其表面光滑，并伴有一些小的凹槽；凍干后的LSPS-Ⅱ呈現(xiàn)白色粉末狀，1萬倍放大后在掃描電鏡下形態(tài)如圖2 B所示，呈不規(guī)則的磚塊狀?？梢奓SPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ?yàn)閮煞N不同的多糖。

圖2 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的掃描電鏡圖

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及多糖含量

以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)，490 nm吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)處理后得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.008X-0.030，r=0.997。實(shí)驗(yàn)表明葡萄糖濃度在0～120 μg·mL-1范圍內(nèi)，吸光度與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到，硫磺菌粗多糖(LSPS)的多糖含量為(39.13±1.02)%。經(jīng)過DEAE-52色譜柱得到純化的硫磺菌多糖LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ，分別為(85.43±1.23)%和(80.12±1.19)%。此結(jié)果表明，經(jīng)過DEAE-52纖維素色譜柱的純化，硫磺菌多糖的純度有了明顯的提高。

2.4 IR分析

LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的紅外光譜儀掃描結(jié)果見圖3。由圖 3 可知，LSPS-Ⅰ在3 421 cm-1處有一明顯吸收峰，此為多糖特征性O(shè)-H的伸縮振動(dòng)峰，是由糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)而引起的吸收，形寬且鈍，說明羥基不是游離的，而是在分子間發(fā)生了締合[10]；2 927 cm-1附近的吸收峰為次甲基(-CH2)中-C-H的伸縮振動(dòng)的吸收峰；1 652 cm-1附近的吸收峰為 C=O 伸縮振動(dòng)峰[11]；1 419 cm-1附近的吸收峰可能是由-COOH中的C-O鍵伸縮振動(dòng)或是C-H鍵的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)引起的[12]；1 020 cm-1附近的吸收峰是由C-O-H和吡喃糖環(huán)的C-O-C中的兩種C-O鍵的伸縮振動(dòng)引起的[13]。

圖3 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的紅外光譜圖

LSPS-Ⅱ在3 421 cm-1處有吸收，這是 O-H 伸縮振動(dòng)，與 LSPS-Ⅰ 相似，說明羥基在分子間締合；2 931 cm-1附近的吸收峰為C-H 伸縮振動(dòng)；1 652 cm-1附近的吸收峰為 C=O 伸縮振動(dòng)峰；1 419 cm-1附近有與LSPS-Ⅰ相似的吸收峰；1 024 cm-1附近有與LSPS-Ⅰ相似的吸收峰。

綜上所述，由紅外圖譜可知LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均具有明顯的糖類化合物的特征。

2.5 1H-NMR分析

LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的1H-NMR分析見圖 4。1H-NMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu)型及結(jié)構(gòu)中氫個(gè)數(shù)比的問題，但是由于非異頭質(zhì)子化學(xué)位移δ相近，且有部分重疊現(xiàn)象，使多數(shù)質(zhì)子信號(hào)較難解析，一般β型異頭質(zhì)子區(qū)域化學(xué)位移位于δ4.4～5.0，α型異頭質(zhì)子區(qū)域化學(xué)位移位于δ5.0～5.5[14]。LSPS-Ⅰ的1H-NMR 信號(hào)中有δ5.35、5.17和5.14，LSPS-Ⅱ的1H-NMR 信號(hào)有δ5.39，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的1H-NMR信號(hào)均集中在δ5.0～5.5可見這兩種多糖均存在α-糖苷構(gòu)型異頭氫。圖4中化學(xué)位移在δ3.4～4.2之間的信號(hào)主要是糖殘基上 C2-H 到 C6-H 的信號(hào)位移峰[15]。綜上分析結(jié)果表明，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均為主要以α構(gòu)型鏈接的多糖。

圖4 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的核磁共振氫譜圖

2.6 對(duì)DPPH·的清除活性

由圖5可知，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT比較，對(duì)DPPH·均有一定的清除活性，兩種多糖在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度增大，清除率相應(yīng)提高，當(dāng)樣品濃度為6 mg·mL-1時(shí)，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的DPPH·清除率分別為(40.64±0.37)%和(35.49±2.79)%，但陽性對(duì)照BHT在濃度1 mg·mL-1時(shí)，DPPH·清除率已經(jīng)達(dá)到79.82%。計(jì)算得，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ?qū)PPH·清除率的EC50值分別為10.74和15.67 mg·mL-1，LSPS-Ⅰ對(duì)DPPH·的清除活性優(yōu)于LSPS-Ⅱ。

2.7 MTT

通過檢測發(fā)現(xiàn)LSPS-Ⅰ對(duì) BGC 細(xì)胞增殖無抑制效果，LSPS-Ⅱ?qū)?BGC 細(xì)胞增殖的抑制效果見圖6，與標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥物順鉑DDP比較，對(duì)BGC細(xì)胞有一定的抑制作用，在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度增大，抑制率相應(yīng)提高，當(dāng)LSPS-Ⅱ在濃度1000 μg·mL-1對(duì) BGC 的抑制率達(dá)到了(55.64±1.37)%，其IC50值為 848 μg·mL-1，表現(xiàn)出很強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。

圖5 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ?qū)PPH·的清除作用

圖6 LSPS-Ⅱ?qū)GC細(xì)胞的抑制作用

3 討論和結(jié)論

硫磺菌作為一種珍貴的食藥用真菌，本實(shí)驗(yàn)室已完成對(duì)其的野生馴化并高產(chǎn)栽培。本研究首次從自行栽培的硫磺菌中得到了兩個(gè)多糖組分LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ。由于在多糖純化中色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)對(duì)其的分離造成干擾，所以在分離前期一般進(jìn)行除色素和蛋白的操作。本實(shí)驗(yàn)提取得到的硫磺菌粗多糖本身顏色為白色無色素干擾，所以后期只進(jìn)行了Sevage法除蛋白的操作。

由于多糖的分子結(jié)構(gòu)等與其生物學(xué)活性具有密切的關(guān)系，弄清多糖的結(jié)構(gòu)可以更深入的揭示其在生命過程中的作用[16]。多糖結(jié)構(gòu)的檢測手段有很多，本實(shí)驗(yàn)主要采用 SEM 觀察了LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的物理結(jié)構(gòu)，采用苯酚硫酸法檢測了它們的多糖純度，對(duì)于多糖純度的檢測，由于目前尚未找到比較合適的標(biāo)準(zhǔn)品，因此通過各種方法得到的多糖純度仍是比較粗略的結(jié)果[17]。采用 IR 和1H-NMR 分析了它們的糖鍵結(jié)構(gòu)，表明LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均具有糖類物質(zhì)的吸收峰且為α構(gòu)型。

本實(shí)驗(yàn)采用清除DPPH·實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的體外抗氧化活性，結(jié)果顯示這兩種多糖均具有較好的體外自由基清除能力，且均呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)還探討了LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ?qū)GC細(xì)胞的抑制作用，LSPS-Ⅱ?qū)?BGC 細(xì)胞增殖的具有較好的抑制效果。綜上所述，分離自硫磺菌子實(shí)體的多糖組分LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ可作為抗氧化劑和抗腫瘤制品進(jìn)一步研究，并應(yīng)用于食品醫(yī)藥領(lǐng)域。