李耀, 何葉子, 陳曉龍,2,3, 闞建全,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715) 3(中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶，400715)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)含有多種生理活性成分，如揮發(fā)油類、生物堿類和酰胺類物質(zhì)，目前從花椒中分離純化得到的酰胺類物質(zhì)主要是山椒素及其羥基山椒素(見(jiàn)圖1)，這類酰胺物質(zhì)被稱為花椒麻味物質(zhì)，山椒素是最能代表花椒引起麻刺感的成分，花椒麻味物質(zhì)具有麻醉、興奮、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)和鎮(zhèn)痛等功效，在食品醫(yī)藥、化妝品等方面具有良好的應(yīng)用前景[1-2]?；ń仿槲段镔|(zhì)在空氣中易氧化，目前還沒(méi)有商品化的標(biāo)準(zhǔn)品，傳統(tǒng)分離純化方法存在繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而花椒麻味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、含量等方面還有待深入研究，因此迫切需要研究出花椒麻味物質(zhì)更加高效的分離純化方法[3-4]。分子印跡技術(shù)為花椒麻味物質(zhì)的分離純化提供了新的思路。在分子印跡技術(shù)中，采用與印跡分子結(jié)構(gòu)相似的化合物作為替代模板分子(dummy template molecular)，可以解決一些印跡分子難獲得、溶解性差等問(wèn)題[5-6]。用替代模板分子制備的分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)印跡分子仍具有較好的印跡效果[7-8]。近些年替代模板分子印跡快速發(fā)展，但目前仍未見(jiàn)有關(guān)花椒麻味物質(zhì)的替代模板分子印跡技術(shù)的報(bào)道。

現(xiàn)有花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品制備過(guò)程繁瑣、成本高，其分子鏈上的多個(gè)不飽和碳碳雙鍵容易發(fā)生共價(jià)鍵化學(xué)反應(yīng)，使花椒麻味物質(zhì)不易洗脫[9]；為解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)合成一種羥基山椒素的結(jié)構(gòu)類似物L(fēng)M2(見(jiàn)圖1-d)作為花椒麻味物質(zhì)的分子印跡替代模板分子(理論分子質(zhì)量為271)，采用本體聚合法制備了花椒麻味物質(zhì)替代模板分子印跡聚合物(MIPs)，并對(duì)其吸附性能和分子識(shí)別能力進(jìn)行了考察，以期為高純度花椒麻味物質(zhì)的分離提取奠定基礎(chǔ)。

a-α-山椒素(R=H)和羥基-α-山椒素(R=OH);b-β-山椒素R=H和羥基-β-山椒素 R=OH;c-γ-山椒素 R=H及羥基-γ-山椒素 R=OH;d-替代模板的分子結(jié)構(gòu)圖圖1 花椒麻味物質(zhì)主要成分及替代模板的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of acid amide components identifiedin pepper and the molecular structure analogs ofsanshool acid amide components

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻味物質(zhì)(HJMS)標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%以上)，按照逆流干柱層析法、制備型HPLC法等工序制備[10]；鮮花椒，重慶凱揚(yáng)農(nóng)業(yè)有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、2-乙烯基吡啶(2-Vpy)均為分析純，阿拉丁公司；偶氮二異丁腈(AIBN)、氯仿、甲醇、冰乙酸、乙腈均為分析純，成都科隆試劑公司；1-氨基-2-甲基-2-丙醇、二異丙基乙基胺、1-羥基苯并三唑(HOBT)、月硅酸、異丁胺、1-H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽均為分析純，Sigma試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

DSHZ-300型水浴振蕩儀，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5810型離心機(jī)，艾本德公司；超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；HPLC 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；CP214型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；Equinox55傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；HITACHI S-3400N I型掃描電鏡，Hitachi Science Systems；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，BUCHI公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒麻味物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物的合成方法[11]

取10 mmol月桂酸，于500 mL圓底燒瓶中，加入10 mmol的1-氨基-2-甲基-2-丙醇和20 mmol的二異丙基乙基胺，用60 mL無(wú)水DMF溶解后，于0 ℃冰浴下加入催化劑1-H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)，30 ℃下攬拌反應(yīng)24 h后，往混合液中加入200 mL水和100 mL乙酸乙酯稀釋，于500 mL分液漏斗中分層萃取，有機(jī)層用40 mL濃度為1 mol/L的NaOH和40 mL濃度為1 mol/L的HCl分別洗滌3次，再用40 mL的NaHCO3洗滌1次后用40 mL飽和NaCl洗滌，最后用無(wú)水硫酸鈉干燥1 h，傾倒出溶解有產(chǎn)物的乙酸乙酯溶液作為過(guò)硅膠柱層析的上樣液；薄層色譜點(diǎn)板以確定產(chǎn)物的層析位置，以乙酸乙酯/石油醚(V/V=1∶2)作為展開(kāi)劑，濕法上樣，進(jìn)行硅膠柱層析純化，根據(jù)薄層色譜點(diǎn)板的結(jié)果接收含有產(chǎn)物部分的過(guò)柱流出液，將含有產(chǎn)物的流出液旋蒸干，將結(jié)晶產(chǎn)物溶解在少量石油醚中重結(jié)晶，得到無(wú)色固體結(jié)晶，即為L(zhǎng)M2。

1.3.2 花椒麻味物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物(LM2)的結(jié)構(gòu)確證

核磁共振氫譜和碳譜檢測(cè)：取6 mg的結(jié)構(gòu)類似物L(fēng)M2于核磁管中，常溫下分別加入0.5 mL氘代氯仿(CDCl3)使之完全溶解，上超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定1H-NMR和13C-NMR圖譜，1H-NMR設(shè)置核磁兆數(shù)400 MHz，13C-NMR設(shè)置核磁兆數(shù)101 MHz。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)條件[10]：DB-5 ms毛細(xì)管柱，30 mm×0.25 mm；載氣氦氣，流速30 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；接樣口溫度280 ℃；柱溫80 ℃，升溫速度5℃/min；進(jìn)樣量1 μL。倍增電壓：1 963 eV；離子源能量70 eV，發(fā)射電流2 mA；離子源溫度250 ℃。掃描速度0.82循環(huán)/s，掃描質(zhì)量范圍(m/z)：35～500，標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)NIST05。

1.3.3 花椒麻味物質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]

HPLC色譜檢測(cè)條件：色譜柱-Agilent EclipseXDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相-甲醇∶水(體積比60∶40)，流速-1 mL/min，保留時(shí)間15 min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。以高相液相色譜目標(biāo)峰的平均面積(Y)對(duì)濃度(X，mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：Y=18 040X+265(R2=0.999)。

1.3.4 花椒麻味物質(zhì)分子印跡聚合物的制備[13]

取67.75 mg(0.25 mmol)替代模板分子于50 mL燒瓶中，加入12 mL乙腈，1 mmol功能單體2-Vpy，充分溶解后，放置過(guò)夜；加入5 mmol交聯(lián)劑EDMA和10 mg引發(fā)劑AIBN，充分溶解后，向混合液中通氮?dú)?0 min，使瓶?jī)?nèi)保持惰性氛圍，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用封口膜密封燒瓶；于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合4 h后再于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合20 h，得乳白色塊狀聚合物，將聚合物反復(fù)研磨，過(guò)200目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩；用丙酮自然沉降3次，每次1 h，棄去上層濁液，以除去聚合物中過(guò)細(xì)小的粒子；真空干燥處理沉淀物，以甲醇-乙酸(體積比9∶1)為洗脫液進(jìn)行索氏提取，直至索氏提取器內(nèi)溶液不含替代模板分子為止；用甲醇反復(fù)洗滌聚合物，將處理好的聚合物置于真空干燥箱內(nèi)，50 ℃干燥至恒重，即制備了花椒麻味物質(zhì)替代模板分子印跡聚合物(MIPs)。

空白印跡聚合物(NIPs)的制備及處理方法與MIPs相同，只是在聚合物合成過(guò)程中不加入替代模板分子[14]。

1.3.5 分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附試驗(yàn)

稱取50 mg替代模板分子印跡聚合物，置于20 mL具塞錐形瓶中，加入8 mL一定濃度的HJMS氯仿溶液，于振蕩器上25 ℃下150 r/min振蕩12 h后，倒入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，高效液相色譜法測(cè)定上層清液中HJMS濃度，差減法計(jì)算該聚合物對(duì)HJMS的吸附量Q[15]，計(jì)算公式見(jiàn)式(1)，

Q=(C1-C0)V/M

(1)

其中：Q為MIPs的吸附容量,mg/g；C1為氯仿溶液中HJMS的原始濃度,μg/mL；C0為吸附后上層清液中HJMS的濃度,μg/mL；V為氯仿溶液的體積,mL；M為MIPs的重量,g。

1.3.6 MIPs和 NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

稱取50.0 mg MIPs和50.0mg NIPs，分置于20 mL具塞錐形瓶中，然后分別加入8 mL濃度為250 μg/mL的HJMS氯仿溶液，放入25 ℃恒溫振蕩器中(150 r/min)，每隔2、4、6、8、10、12、14 h取出MIPs和NIPs上清液各1份，測(cè)定其中HJMS濃度，繪制吸附容量Q(mg/g)與吸附時(shí)間t之間的變化曲線[16]。

1.3.7 MIPs和 NIPs的等溫吸附試驗(yàn)

分別配制濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL的花椒麻味物質(zhì)氯仿溶液。分別稱取多份50 mg MIPs和NIPs，分置于20 mL具塞錐形瓶中，按濃度梯度在每個(gè)容量瓶中加入8 mL上述溶液，于25℃恒溫振蕩器中振蕩12 h，取出，6 000 r/min離心5 min，高效液相色譜法測(cè)定上層清液中HJMS濃度，計(jì)算吸附容量、特異結(jié)合量、特異因子[17]。

特異結(jié)合量定義為式(2)：

ΔQ=QMIP-QNIP

(2)

特異因子定義為式(3)：

α=QMIP/QNIP

(3)

式中：α為特異因子；QMIP為MIPs的吸附容量；QNIP為NIPs的吸附容量。分子印跡研究中通常用QMIP表示吸附容量，特異因子α表示印跡效果。

用Scatchard模型評(píng)價(jià)MIPs的吸附特性，計(jì)算公式為式(4)：

Q/C=(Qmax-Q)/Kd

(4)

式中：Kd為結(jié)合位點(diǎn)的解離平衡常數(shù)；Qmax為結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量,mg/g；Q為MIPs對(duì)目標(biāo)分子的吸附容量,mg/g；C為平衡時(shí)吸附液中目標(biāo)分子的濃度,mg/mL[18]。

1.3.8 花椒麻味物質(zhì)分子印跡聚合物的電鏡表征

稱取SMIP和SNIP粉末各100 mg，過(guò)200目篩后鍍金，于掃描電鏡下觀測(cè)樣品表觀形態(tài)[19]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Origin 8.0和Excel 2003處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差”來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM2 的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

由圖2可以看出，該花椒麻味物質(zhì)的分子印跡替代模板分子LM2主要成分只有1個(gè)峰，按峰面積歸一化法進(jìn)行積分計(jì)算，可估算出結(jié)構(gòu)類似物L(fēng)M2的相對(duì)百分含量在95%以上。通過(guò)分析主峰的離子質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)LM2的加氫離子峰(M+H)的最大質(zhì)荷比為272，減去氫質(zhì)子即為271，按照分子式C16H33NO2計(jì)算的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為271，質(zhì)譜圖顯示的最大質(zhì)荷比與理論上計(jì)算出的相對(duì)分子質(zhì)量相吻合[12]。

圖2 LM2的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜Fig.2 Total ion current chromatogram and Massspectrogram peak of LM2

2.2 LM2 的核磁共振氫譜圖和碳譜圖分析

LM2(分子式C16H33NO2)的核磁解譜數(shù)據(jù)：1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 6.06 (s, 1H), 3.26 (d,J=6.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 2H), 2.20～2.24 (m, 2H), 1.86 (s, 1H), 1.68～1.60 (m, 2H), 1.38～1.30 (m, 6H), 1.26 (s, 8H), 1.22 (s, 6H), 0.88 (t,J=6.9 Hz, 3H)。13C-NMR (101 MHz, CDCl3):δ 174.4, 70.9, 50.3, 36.8, 31.9, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 28.9,28.6,27.3, 25.9, 22.7, 14.1.

由圖3可知，氫原子的化學(xué)位移數(shù)可以與理論上對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)吻合，經(jīng)積分計(jì)算，氫原子有33個(gè)，與理論個(gè)數(shù)一致，碳譜上顯示碳原子均有15個(gè)，理論上LM2碳原子個(gè)數(shù)均為16，這是因?yàn)楫惗』糠钟袃蓚€(gè)對(duì)稱的甲基碳的化學(xué)位移發(fā)生重疊，從核磁氫譜和核磁碳譜中看不出明顯雜質(zhì)干擾，說(shuō)明合成的LM2產(chǎn)物純度較高。

圖3 LM2的1H-NMR譜圖和13C-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR spectrum of LM2

2.3 分子印跡聚合物的電鏡掃描表征

由圖4可知，MIPs與NIPs相比，立體效果更加明顯，表面有更多孔隙；MIPs具有良好的分散性，而NIPs表面看起來(lái)分散不均與，形狀不規(guī)則，有結(jié)塊現(xiàn)象發(fā)生。經(jīng)比較可知，制備分子印跡聚合物過(guò)程中加入替代模板分子，對(duì)形成特異性吸附花椒麻味物質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)鍵作用[20]。

圖4 MIPs(A)和 NIPs(B)的掃描電鏡圖(×10 000)Fig.4 The SEM photos of MIPs and NIPs(×10 000)

2.4 MIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

由圖5可知，MIPs和NIPs對(duì)HJMS的吸附容量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，最后達(dá)到吸附平衡。MIPs和HJMS的接觸時(shí)間約10 h時(shí)就基本達(dá)到吸附平衡，達(dá)到吸附平衡后的吸附容量幾乎保持不變，MIPs對(duì)HJMS的吸附容量為(15.34±0.85) mg/g。這是因?yàn)镸IPs表面存在結(jié)合位點(diǎn)，其內(nèi)部也存在結(jié)合位點(diǎn)，而結(jié)合位點(diǎn)分布不均勻，剛開(kāi)始吸附時(shí)，目標(biāo)分子與表面結(jié)合位點(diǎn)快速結(jié)合，隨著表面結(jié)合位點(diǎn)的飽和，產(chǎn)生空間位阻，目標(biāo)分子與內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)逐漸緩慢結(jié)合，最終MIPs吸附目標(biāo)分子達(dá)到飽和[21]。

圖5 MIPs及NIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)分析Fig.5 Binding dynamics of MIPs and NIPs to HJMS

2.5 MIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的等溫吸附試驗(yàn)

由圖6可知，隨著底物HJMS的濃度增大，MIPs的吸附容量明顯增大，NIPs的吸附容量則增大緩慢。這說(shuō)明MIPs對(duì)HJMS有較強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，而空白印跡聚合物的這種能力很弱[22]，這是因?yàn)樘娲０宸肿釉贛IPs中留下了對(duì)HJMS有特異識(shí)別性的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點(diǎn)，而NIPs對(duì)HJMS的吸附作用主要是分子間作用力。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了花椒麻味物質(zhì)在MIPs和NIPs上的結(jié)合等溫線，MIPs的擬合等溫吸附方程為y=1.363+66.127x-42.509 9x2，NIPs的擬合等溫吸附方程為y=1.357 2+29.836 4x-43.735 0x2，其中y表示吸附容量Q，x表示花椒麻味物質(zhì)的初始濃度C，該擬合等溫吸附方程為研究MIPs對(duì)HJMS的特異性吸附能力、對(duì)其進(jìn)行定量分析構(gòu)建了理論模型。

圖6 MIPs和NIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的吸附等溫曲線Fig.6 The adsorption isotherms of MIPs and NIPs to HJMS

2.6 MIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的Scatchard模型分析

由圖7可知，MIPs吸附花椒麻味物質(zhì)的Scatchard曲線，整體上呈非線性關(guān)系，可分為2段，2條斜率不同的直線均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在質(zhì)量HJMS濃度為0.05～0.30 mg/mL時(shí)，MIPs對(duì)HJMS形成高親和性結(jié)合位點(diǎn)和低親合性結(jié)合位點(diǎn)[23]，其原因是在聚合過(guò)程中，替代模板分子與功能單體形成比例不同的復(fù)合物，使非共價(jià)結(jié)合作用力的大小不均勻[24]。以這兩段線性關(guān)系為依據(jù)，分別進(jìn)行線性擬合，得到MIPs的Scatchard擬合方程Q/C=267.206 6-15.280 5Q(R2=0.999 7)和Q/C=145.829 9-3.239 3Q(R2=0.969 5)，其中Q為MIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)的吸附容量、C為吸附平衡時(shí)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量濃度。由Scatchard曲線(圖6)的斜率和截距計(jì)算可得：高親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd1=6.544×10-2mg/mL，結(jié)合位點(diǎn)最大結(jié)合量為Qmax1=17.487mg/g；低親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd2=3.087×10-1mg/mL；結(jié)合位點(diǎn)最大結(jié)合量為Qmax2=45.019 mg/g。NIPs的Scathcdard模型可擬合成一條直線，這是因?yàn)镹IPs只存在一種非特異性的吸附位點(diǎn)[25]。

圖7 分子印跡聚合物對(duì)HJMS的Scatchard分析圖Fig.7 Scatchard Plots Analysis of MIPs and NIPs for HJMS and LM2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用成功合成的LM2為替代模板分子，本體聚合的方法制備了MIPs，MIPs與HJMS接觸時(shí)間約10 h可達(dá)到吸附平衡，對(duì)花椒麻味物質(zhì)特異因子α可達(dá)到2.53；在吸附過(guò)程中HJMS與MIPs形成兩種結(jié)合位點(diǎn)，高親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd1=6.544×10-2mg/mL，結(jié)合位點(diǎn)最大結(jié)合量為Qmax1=17.487 mg/g；低親和力結(jié)合位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd2=3.087×10-1mg/mL，結(jié)合位點(diǎn)最大結(jié)合量為Qmax2=45.019 mg/g；結(jié)果表明，MIPs對(duì)花椒麻味物質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性吸附能力。