王瀟 陳健* 張鑫 何劍全 黃慧

1. 廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361000 2. 廈門大學附屬中山醫(yī)院康復科，福建 廈門 361000

破骨細胞作為體內唯一的骨再吸收細胞，它通過與骨表面之間形成微環(huán)境來降低骨基質的成分[1]，所以破骨細胞是骨質疏松和骨折預防和治療方面的重要靶點。研究表明，在骨吸收的過程中，附著于骨骼表面的破骨細胞在酸性的條件下先溶解骨礦物質，繼而降解骨基質成分。在此過程中，V-ATP酶的表達對骨吸收所必需的酸性微環(huán)境起到了至關重要的作用[2,3]。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)對破骨細胞V-ATP酶表達的影響尚不十分明確。本實驗通過觀察TNF-α及TNF-α抗體對破骨細胞V-ATP酶的影響，來探討TNF-α提高破骨細胞的骨吸收活性的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7購于上海傅衡生物科技有限公司，核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(PeropTech,USA)，TNF-α(PeropTech,USA)，TNF-α抗體(abcam)，胰蛋白酶(GIBCO)，雙抗(HyClone)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP) 染色試劑盒(Sigma)，TRIZOL(ambion)，RNA 逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)(TaKaRa)，熒光定量PCR 試劑(TaKaRa)，V-ATP酶抗體(GenScript)，引物(上海生工)，PCR擴增儀(普通mycycler) (BIO-RAD，美國)，ABI 7500 型熒光定量PCR儀(美國ABI)，F(xiàn)luorChem HD2成像系統(tǒng)(美國Protein slmple)。

1.2 破骨細胞的誘導及鑒定

將RAW264.7細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清及1%的雙抗)，置入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)(溫度為37 ℃，CO2的體積分數(shù)為5%)。24小時待細胞貼壁后，加入50ng/mL的RANKL誘導因子。隔日換液1次，并保持RANKL的終濃度為50 ng/mL。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況。培養(yǎng)6天后做TRAP染色鑒定。按照TRAP染色試劑盒配置固定液和染色液。PBS洗1次，加固定液固定30 s，用去離子水徹底沖洗，再加TRAP染色液，置入37 ℃恒溫箱避光孵育1 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍片。

1.3 實驗分組

細胞分為對照組，TNF-α干預組和TNF-α抗體干預組。均用50ng/mL的RANKL誘導8天，其中TNF-α干預組在RANKL誘導6天后分別用低濃度(20ng/mL)、中濃度(50ng/mL)、高濃度(80ng/mL)的TNF-α干預48 h；TNF-α抗體干預組在RANKL誘導6天后分別用低濃度(20ng/mL)、中濃度(50ng/mL)、高濃度(80ng/mL)的TNF-α抗體干預48 h。

1.4 V-ATP酶基因和蛋白表達檢測

實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)檢測mRNA表達：Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，逆轉錄設定的反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃結束。在ABI7500熒光定量PCR儀上進行實時檢測，所用引物見表1。實時熒光定量PCR采用20 μL反應體系，包含前后引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye II，6 μL 無酶水與2 μL的cDNA。反應條件為：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5s，60 ℃ 34 s 四十個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析結果。

表 1 real-time PCR所用目的基因及引物Table 1 Primers of genes used in real-time PCR

Western blot檢測蛋白質表達：用RIPA緩沖液提取破骨細胞的總蛋白，煮沸變性10分鐘，進行凝膠電泳后轉膜。然后與V-ATP酶兔抗鼠單克隆一抗4 ℃孵育過夜，GAPDH作為內參。羊抗兔IgG二抗孵育1 h。用Image J分析軟件檢測膜上每個條帶的相對灰度值，測出各組蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 破骨細胞檢測

接種24 h后，細胞開始逐漸貼壁，體積較小，均勻一致。在50ng/mL的RANKL的誘導下，6天后可見很多體積較大的多核細胞，呈圓形、梭形或不規(guī)則形狀。TRAP染色呈陽性(圖1)，細胞內含有多個細胞核，細胞質內可見大小不等的空泡。

圖1 倒置相差顯微鏡下破骨細胞TRAP染色× 40Fig.1 Inverted phase contrast microscopic appearance of some typical rat osteoclast cells stained with TRAP (×40)

2.2 real-time PCR檢測V-ATP酶mRNA的表達

破骨細胞分別與TNF-α及TNF-α抗體經(jīng)過48 h共培養(yǎng)后，對照組、不同濃度TNF-α干預組及不同濃度TNF-α抗體干預組V-ATP酶的mRNA相對表達量見圖2、圖3。低、中、高濃度TNF-α干預組V-ATP酶的mRNA 表達量顯著高于對照組(P<0.000 1)；低、中、高濃度TNF-α抗體干預組V-ATP酶的mRNA表達量顯著低于對照組(P<0.000 1)。該結果提示TNF-α能夠顯著提高V-ATP酶的mRNA表達；TNF-α抗體能夠顯著降低V-ATP酶的mRNA表達。

圖2 不同濃度TNF-α對V-ATP酶mRNA表達量的影響 (***P<0.000 1)Fig.2 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the mRNA expression of V-ATPase

圖3 不同濃度TNF-α抗體對V-ATP酶mRNA表達量的影響 (***P<0.000 1)Fig.3 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the mRNA expression of V-ATPase

2.3 Western-blot檢測V-ATP酶蛋白的表達

破骨細胞分別與TNF-α及TNF-α抗體經(jīng)過48 h共培養(yǎng)后，對照組、不同濃度TNF-α干預組及不同濃度TNF-α抗體干預組V-ATP酶的蛋白表達見圖4、圖5。TNF-α干預組V-ATP酶蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)；TNF-α抗體干預組V-ATP酶的蛋白表達量明顯低于對照組(P<0.05)。該結果提示TNF-α能夠顯著提高V-ATP酶的蛋白表達；TNF-α抗體能夠顯著抑制V-ATP酶的蛋白表達。

圖4 不同濃度TNF-α對破骨細胞V-ATP酶蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the protein expression of V-ATPase

圖5 不同濃度TNF-α抗體對破骨細胞V-ATP酶蛋白表達量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the protein expression of V-ATPase

3 討論

TNF-α是參與骨骼重塑的幾種炎性細胞因子之一，它可以由正常的破骨細胞合成，主要作用是通過促進破骨細胞形成和抑制成骨細胞的功能而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài)[5]。TNF-α作為TNF 家族重要成員之一，可以刺激成骨細胞產(chǎn)生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL6 等因子，誘導破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞。也可以影響成骨細胞骨保護素(OPG)和RANKL的基因表達，從而調控破骨細胞的分化和活化[6]。研究表明，TNF-α不僅可以促進巨噬細胞或骨髓基質干細胞分化為破骨細胞，而且也可以提高破骨細胞的骨吸收活性[4]。

V-ATP酶是一種高度表達于破骨細胞膜上的特殊蛋白質，對控制細胞內的pH值的生理過程起著重要的作用，所以，其表達量對破骨細胞性骨吸收起著至關重要的作用[2,3]。V-ATP酶的核心結構由V1和V0兩個不同的結構域及輔助亞基AC45和M8-9組成[7]。V1部分位于細胞質內，是一個570 ku的復雜結構域，由(A，B， C，D，E，F(xiàn)，G和H)8個不同的亞基構成，主要負責ATP的水解[8,9]。V0部分則位于跨膜區(qū)，是一個260 ku的復合體，由(a、d、e、c、c′、c″)6個不同的亞基組成，主要負責質子的轉移[10]。在骨吸收的過程中，破骨細胞先貼附于骨表面，形成相對隔絕的細胞外骨吸收微環(huán)境，然后在酸性條件下溶解骨礦物質，繼而降解骨基質成分[11]。研究發(fā)現(xiàn)，V-ATP酶以高密度在特定的細胞膜中表達，如腎閏細胞和破骨細胞等，它們在尿液酸化、破骨細胞的骨吸收中發(fā)揮著重要的作用[12]。破骨細胞分泌氫離子溶解羥基磷灰石晶體是骨骼脫鈣的重要環(huán)節(jié)，其中，破骨細胞膜上的V-ATP酶參與氫離子分泌這一關鍵生理過程[7,13]。研究表明，V-ATP酶缺陷是患骨硬化病的常見原因[14]。本研究觀察TNF-α對破骨細胞上V-ATP酶表達量的影響，可以了解TNF-α對提高破骨細胞骨吸收活性的機制。

破骨細胞作為終末細胞不能增殖和傳代，以往獲得破骨細胞的方法是提取鼠骨髓基質干細胞，然后誘導分化得到破骨細胞，這種方法難以獲取大量高純度破骨細胞。故本實驗選用誘導破骨細胞前體細胞RAW264.7向破骨細胞分化。結果顯示，50 ng/mLRANKL誘導RAW264.7細胞，6天后可獲得大量成熟的破骨細胞，且TRAP染色呈陽性。

V-ATP酶在破骨細胞中表達量的增加可導致破骨細胞骨吸收活性的提高。本研究表明不同濃度的TNF-α作用于破骨細胞后，低、中、高濃度組破骨細胞上V-ATP酶mRNA的表達量顯著高于對照組，且呈一定的劑量依賴性；同時，TNF-α干預組破骨細胞上V-ATP酶的蛋白表達量也顯著高于對照組。此外，本研究還用不同濃度TNF-α抗體來干預破骨細胞，觀察破骨細胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表達，結果表明TNF-α抗體可抑制破骨細胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表達，且呈一定的劑量依賴性。由此推測TNF-α作為一個炎癥遞質參與骨吸收的過程中，除了促進破骨細胞形成以外，其可能還通過增加破骨細胞上V-ATP酶的表達，從而增強破骨細胞的骨吸收活性。