于 瑩，張樹(shù)權(quán)，郭永利，姚玉波，周 菲，趙東升，劉繼忠，李文華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086）

土壤鹽堿化已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一。松嫩平原是世界三大蘇打鹽堿土集中分布區(qū)之一，也是我國(guó)重要商品糧基地[1]。該地區(qū)土壤鹽堿化嚴(yán)重影響農(nóng)作物生長(zhǎng)，制約當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。利用鹽堿地有多種途徑，篩選耐鹽堿作物品種是最為經(jīng)濟(jì)有效方法之一[2]。

玉米作為我國(guó)三大重要糧食作物之一，對(duì)鹽分中度敏感，耐鹽性相對(duì)較差。玉米生長(zhǎng)適宜土壤pH 6.5～7.0，極限鹽度1.7 ds·m-1（1 ds·m-1=0.01 mol·L-1NaCl），每超過(guò)極限鹽度1 ds·m-1，產(chǎn)量降低12%[2]。鹽脅迫下，玉米生長(zhǎng)受抑制，芽勢(shì)弱，出苗遲緩，根系生長(zhǎng)不良，相對(duì)活力降低，葉片失綠，嚴(yán)重影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量[3]。目前，玉米耐鹽堿育種研究進(jìn)展緩慢，缺少玉米耐鹽堿種質(zhì)資源。不同玉米品種受基因型、表現(xiàn)型和體內(nèi)生理生化反應(yīng)影響，鹽堿脅迫敏感程度不同，耐鹽堿性差異大[4]。鑒定不同玉米自交系耐鹽堿性，可為玉米耐鹽堿品種選育提供基礎(chǔ)材料。

植物耐鹽性鑒定方法主要包括發(fā)芽期篩選法、苗期鑒定法、營(yíng)養(yǎng)液篩選法、大田鑒定法等。種子萌發(fā)是鹽脅迫下植物生命過(guò)程的關(guān)鍵時(shí)期，其發(fā)芽狀況、胚根胚芽生長(zhǎng)情況均對(duì)后續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育具有決定性作用[5]。研究表明，植物種子萌發(fā)階段對(duì)鹽脅迫較敏感[6]。因此，種子萌發(fā)期是耐鹽性鑒定重要時(shí)期[7]。萌發(fā)期耐鹽性鑒定因其周期短、操作方便、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。

近年來(lái)，研究者從不同角度提出植物耐鹽性鑒定試驗(yàn)設(shè)計(jì)、指標(biāo)選擇、評(píng)價(jià)方法及耐鹽性分級(jí)等方法[8-9]。針對(duì)不同作物和不同育種需求，開(kāi)發(fā)全面耐鹽評(píng)價(jià)方法，如隸屬函數(shù)法[10]、聚類分析法[11]等，采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括鮮重[9]、發(fā)芽率[12]、發(fā)芽勢(shì)[13]、根長(zhǎng)[14]等。其中，多指標(biāo)多方法相結(jié)合的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)，更加真實(shí)可靠。

玉米在鹽堿地改良利用中具有重要作用和應(yīng)用前景，提高和改良玉米品種耐鹽堿能力已成為玉米育種重點(diǎn)目標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)耐鹽堿玉米種質(zhì)資源匱乏、遺傳基礎(chǔ)狹窄、耐鹽堿玉米品種較少，選育與鑒定耐鹽堿玉米自交系是耐鹽堿玉米品種培育關(guān)鍵。本研究分別采用中性鹽NaCl和堿性鹽NaHCO3鹽堿脅迫處理31份玉米自交系，在萌發(fā)期選用相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重、相對(duì)根鮮重、相對(duì)芽干重、相對(duì)根干重等10個(gè)指標(biāo)計(jì)算隸屬函數(shù)值并聚類分析，以期篩選出萌發(fā)期耐鹽堿性較強(qiáng)的玉米自交系，為耐鹽堿玉米品種選育提供種質(zhì)資源及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所自育和外引的31份不同基因型玉米自交系（見(jiàn)表1），編號(hào)命名為Z1-Z31。

表1 31份玉米自交系血緣類型Table1 Pedigreeof 31 maize inbred lines

1.2 方法

1.2.1 鹽堿脅迫下萌發(fā)試驗(yàn)

選取籽粒成熟、飽滿且大小適中、均勻一致玉米種子，75%乙醇消毒3 min，滅菌蒸餾水沖洗3遍，濾紙吸干附著水分，將30粒種子播于鋪有雙層濾紙9 cm滅菌培養(yǎng)皿中，分別向培養(yǎng)皿中加入15 mL 100 mmol·L-1NaCl和75 mmol·L-1NaHCO3溶液，以無(wú)菌水作對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，以萌發(fā)幼芽達(dá)種子長(zhǎng)度1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第2、4、6、8天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，第8天取10株幼苗測(cè)量根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，稱量根鮮重、芽鮮重，105℃殺青30 min后，70℃烘干至恒重，稱量根干重和芽干重，萬(wàn)分之一天平稱重[10]。

1.2.2 耐鹽堿評(píng)價(jià)方法

根據(jù)種子發(fā)芽情況計(jì)算各指標(biāo)公式如下[15-16]：發(fā)芽率（%）=（第8天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試試驗(yàn)種子粒數(shù)）×100%；發(fā)芽勢(shì)（%）=（第4天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試試驗(yàn)種子粒數(shù)）×100%；發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt），Gt為t天發(fā)芽率，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)；活力指數(shù)（VI）=GI×S（cm），其中S為發(fā)芽第8天芽長(zhǎng)。為消除不同玉米自交系遺傳背景差異，采用性狀相對(duì)值作為評(píng)價(jià)玉米自交系耐鹽堿性指標(biāo)，即耐鹽堿系數(shù)。耐鹽堿系數(shù)=鹽堿脅迫指標(biāo)平均值/對(duì)照指標(biāo)平均值。利用模糊數(shù)學(xué)法求隸屬函數(shù)值（Membership value，MV）綜合分析不同玉米自交系種子萌發(fā)期耐鹽堿性。隸屬函數(shù)值U（Xi）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）（i=1，2，3，…，N），其中，Xi為指標(biāo)測(cè)定值，Xmin和Xmax分別為參試材料某一指標(biāo)最小值和最大值。先計(jì)算各指標(biāo)隸屬值，再累加每項(xiàng)指標(biāo)隸屬值求平均值，平均值越大表明其耐鹽性越強(qiáng)，根據(jù)隸屬函數(shù)均值作聚類分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并計(jì)算隸屬函數(shù)值，SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件作聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對(duì)不同玉米自交系萌發(fā)的影響

統(tǒng)計(jì)分析鹽堿脅迫下31份玉米自交系萌發(fā)期各指標(biāo)變化（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，不同玉米自交系對(duì)照中各性狀變異系數(shù)為0.20～1.06，表明本試驗(yàn)所選玉米自交系類型豐富；中性及堿性鹽脅迫下各性狀變異系數(shù)分別為0.33～0.93和0.24～0.77，鹽堿脅迫下許多指標(biāo)變異幅度增大，如發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長(zhǎng)、芽鮮重、芽干重，說(shuō)明這些指標(biāo)對(duì)鹽堿脅迫反應(yīng)較敏感。

表2 鹽堿脅迫下不同玉米自交系萌發(fā)期各指標(biāo)變化Table 2 Changes of the germination indices for 31 maize inbred lines under saline-alkalinestress

由表2可知，與對(duì)照相比，鹽堿脅迫下，31份玉米自交系發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、芽鮮重、根鮮重、芽干重、根干重平均值均減少，說(shuō)明鹽堿脅迫對(duì)玉米自交系種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有抑制作用。尤其是活力指數(shù)受抑制程度最大，中性和堿性鹽脅迫均值分別是對(duì)照35%和27%。地下部分根較地上部分芽受抑程度大。從發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長(zhǎng)、芽鮮重等指標(biāo)均值看，堿性鹽脅迫抑制作用大于中性鹽脅迫（且堿性鹽脅迫濃度小于中性鹽脅迫）。

2.2 31份玉米自交系萌發(fā)期耐鹽堿性差異

與絕對(duì)值相比，相對(duì)值排除品種本身差異因素，可更好解釋不同玉米自交系萌發(fā)期耐鹽堿性差異，即采用耐鹽堿系數(shù)作綜合評(píng)價(jià)（見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，中性鹽脅迫下31份玉米自交系相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重、相對(duì)根鮮重、相對(duì)芽干重、相對(duì)根干重等指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)高于平均值的分別有13份、14份、12份、10份、14份、16份、16份、13份、13份、12份；堿性鹽脅迫下，各指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)高于平均值的分別有11份、14份、14份、12份、12份、14份、14份、11份、15份、11份。同一自交系不同指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)或同一指標(biāo)不同自交系耐鹽堿系數(shù)均有較大差異，單一鑒定指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)難以全面、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同玉米自交系耐鹽堿性，需要綜合分析評(píng)價(jià)。

圖1 31份玉米自交系萌發(fā)期各指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)Fig.1 Saline-alkaline tolerancecoefficient of the germination indicesfor 31 maize inbred lines

由圖1可知，僅Z3和Z23所有指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)均低于平均值。各指標(biāo)中部分相對(duì)值大于1，說(shuō)明鹽堿脅迫促進(jìn)該指標(biāo)發(fā)展。Z4、Z9、Z18自交系各指標(biāo)中性鹽脅迫耐鹽堿系數(shù)均高于堿性鹽脅迫，說(shuō)明這些自交系耐中性鹽脅迫能力高于耐堿性鹽脅迫；Z25和Z26則相反，堿性鹽脅迫耐鹽堿系數(shù)較高，說(shuō)明兩個(gè)自交系耐堿性鹽能力高于耐中性鹽。

2.3 31份玉米自交系耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)

隸屬函數(shù)均值是玉米耐鹽堿鑒定重要指標(biāo)，耐鹽堿越強(qiáng)其均值越高[16]。本研究分別分析相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽鮮重、相對(duì)根鮮重、相對(duì)芽干重、相對(duì)根干重等10個(gè)指標(biāo)隸屬度，最后得出隸屬函數(shù)均值（見(jiàn)表3）。由表3可知，中性鹽脅迫下隸屬函數(shù)均值自交系Z11（0.712）最高，Z3（0.051）最低；堿性鹽脅迫下隸屬函數(shù)均值自交系Z14（0.694）最高，Z8（0.002）最低。

表3 鹽堿脅迫下31份玉米自交系萌發(fā)期各指標(biāo)隸屬函數(shù)值Table 3 Membership values of the germination indices for 31 maize inbred lines under saline-alkalinestress

續(xù)表

為更好了解31份玉米自交系綜合耐鹽堿能力，將中性鹽脅迫和堿性鹽脅迫下隸屬函數(shù)均值累加后平均，獲得鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值，根據(jù)鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值對(duì)玉米自交系排序（見(jiàn)表4），運(yùn)用歐氏距離Ward法對(duì)31份玉米自交系作耐鹽堿性聚類分析。結(jié)果表明，31份玉米自交系被劃分為四類：Ⅰ高耐，Ⅱ耐，Ⅲ中耐，Ⅳ敏感（見(jiàn)圖2）。其中，高耐鹽堿自交系6個(gè)（Z1、Z6、Z11、Z14、Z18、Z19），鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值為0.5179～0.696，占供試材料19.35%；耐鹽堿自交系6個(gè)（Z10、Z16、Z20、Z22、Z26、Z29），鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值為0.3771～0.447，占供試材料19.35%；中度耐鹽堿自交系14個(gè)（Z2、Z4、Z5、Z7、Z9、Z12、Z13、Z15、Z17、Z24、Z25、Z28、Z30、Z31），鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值為0.1904～0.3343，占供試材料45.16%；鹽堿敏感自交系5個(gè)（Z3、Z8、Z21、Z23、Z27），鹽堿脅迫隸屬函數(shù)均值為0.0732～0.1297，占供試材料16.13%。

表4 31份玉米自交系耐鹽堿性劃分Table4 Relativetoleranceof 31 maizeinbred linesunder saline-alkalinestress

圖2 31份玉米自交系分級(jí)聚類Fig.2 Classified cluster diagram of 31 maizeinbred lines

3 討論與結(jié)論

我國(guó)東北地區(qū)鹽堿土有害鹽類除中性鹽NaCl外，還有大量以NaHCO3和Na2CO3形式存在的堿性鹽，該類型鹽堿土對(duì)植物傷害作用顯著大于中性鹽土壤[17]。堿性鹽脅迫下，植物受Na+、高pH和HCO3-/CO32-脅迫。目前，關(guān)于植物耐中性鹽脅迫報(bào)道較多，鹽脅迫下植物生長(zhǎng)、光合、蛋白合成、能量和脂類代謝等均受抑制。研究表明，鹽脅迫下玉米萌發(fā)期對(duì)鹽脅迫最敏感，而開(kāi)花期耐鹽能力逐漸增強(qiáng)，耐鹽玉米材料首先應(yīng)具備較強(qiáng)萌發(fā)期耐鹽性[18-19]。關(guān)于鹽脅迫對(duì)玉米種子萌發(fā)影響的研究結(jié)果存在差異。本研究中，部分玉米自交系在中性鹽脅迫下發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于對(duì)照，如1153和PHT11，說(shuō)明本研究的中性鹽脅迫濃度偏低，表明兩個(gè)自交系耐中性鹽脅迫能力較強(qiáng)。

植物形態(tài)變化是反映鹽害最直觀指標(biāo)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、胚芽鮮重、胚根鮮重等指標(biāo)可從不同角度反映種子萌發(fā)期耐鹽性[20]。陳新等研究表明發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、苗高等指標(biāo)可用于裸燕麥品種耐鹽性評(píng)價(jià)[8]。韓飛等研究表明發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)可作為谷子耐鹽性評(píng)價(jià)關(guān)鍵指標(biāo)[14]。孫東雷等認(rèn)為發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率、鮮重、相對(duì)含水量、干重相對(duì)值可作為花生萌發(fā)期耐鹽性篩選指標(biāo)[21]。由于單個(gè)指標(biāo)具有一定片面性，單純從萌發(fā)期某個(gè)指標(biāo)難以確定材料耐鹽性[22]。鹽脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育影響復(fù)雜，采用單一指標(biāo)評(píng)價(jià)玉米自交系耐鹽性時(shí)，由于不同材料脅迫條件下響應(yīng)機(jī)制不同，各指標(biāo)耐鹽性排序會(huì)有不同。如本研究中，中性鹽脅迫下玉米自交系1224相對(duì)發(fā)芽率隸屬函數(shù)值為1，從這一指標(biāo)來(lái)看，該自交系呈現(xiàn)較強(qiáng)耐中性鹽能力，而相對(duì)根長(zhǎng)隸屬函數(shù)值為0.132，表明自交系1224不耐鹽。因此，為提高玉米耐鹽堿性鑒定準(zhǔn)確性，應(yīng)選用不同指標(biāo)綜合分析。隸屬函數(shù)法可充分挖掘各指標(biāo)間深層關(guān)系，避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)片面性，評(píng)價(jià)結(jié)果更科學(xué)、合理。本研究利用10個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)均值劃分31個(gè)玉米自交系耐鹽堿級(jí)別，最終獲得高耐鹽堿玉米自交系6個(gè)，可用于耐鹽堿玉米品種培育，在鹽堿地推廣。