古麗巴哈爾·卡吾力，李玲，常占瑛，王玲，高曉黎

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

0 引 言

蛋白組學(xué)組（Proteome）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)，這個(gè)概念最早是由Marc Wilkins在1994年提出的。

蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明蛋白質(zhì)組學(xué)及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對(duì)正常個(gè)體及病理個(gè)體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，它們可成為新藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，或者也會(huì)為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進(jìn)入后基因時(shí)代的特征[1-5]。

本研究以鮮馬奶乳清蛋白為原料，馬奶是一種具有深厚文化底蘊(yùn)、鮮明地域民族特色的草原資源。馬奶其性味甘涼，含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、磷、鈣、鉀、鈉、維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素C、尼克酸、肌醇等多種成分。具有補(bǔ)虛強(qiáng)身、潤(rùn)燥美膚、清熱止渴的作用。馬奶性味甘涼，善清膽、胃之熱，能療咽喉口齒諸疾。德國(guó)馬奶研究中心的營(yíng)養(yǎng)學(xué)家康尼爾博士說，馬奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在各類乳品中是較高的，它含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些成份參與人體新陳代謝，具有調(diào)節(jié)人體生理功能，提高人體免疫力及防治疾病，不飽和脂肪酸和低分子脂肪酸對(duì)預(yù)防高膽固醇血癥、動(dòng)脈硬化有良好作用。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食結(jié)構(gòu)的要求越來越嚴(yán)格，不僅要考慮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的全面性，而且要注意被機(jī)體實(shí)際吸收利用的多少。隨著馬奶的營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)學(xué)價(jià)值被人們發(fā)掘，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與人們的系統(tǒng)研究不斷深入，篩選出最佳工藝條件，摸清營(yíng)養(yǎng)成分的內(nèi)在聯(lián)系以及通過現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)其諸多藥理作用之后，馬奶必將被受到人們的青睞，成為家家戶戶必備的保健奶食，從而引起社會(huì)各界的重視，充分地開發(fā)和利用它[6-8]。

因此本研究通過二維電泳或SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，通過分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，并且對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點(diǎn)所在的膠區(qū)域進(jìn)行精確切割。接著對(duì)膠中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切消化，酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點(diǎn)樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到特定的材料的表面，在質(zhì)譜（QE-LC-MS）系統(tǒng)中進(jìn)行分析，從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù)；這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)或和已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，通過GO法對(duì)以檢測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類，揭示鮮馬奶生物學(xué)功能，為今后鮮馬奶的功能研究及定位提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

strata-X C18除鹽柱（phenomenex）；戴安納升液相；ThermoFisher Q-Exactive質(zhì)譜儀；IKA振蕩器；離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX-100手掌式離心機(jī)（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋（長(zhǎng)安科學(xué)儀器），電泳系統(tǒng)。軟件系統(tǒng)：Mascot版本（2.3.0.1）；Proteome Discoverer（1.3.0.339）。

鮮馬奶（新疆烏魯木齊市水西溝鎮(zhèn)）；Proteominer試劑盒（Bio-Rad公司）；二硫素糖醇（DTT）（Promega公司，化學(xué)純）；碘乙酰胺（IAM）（Promega公司，化學(xué)純）；甲酸（北京化工廠，質(zhì)譜純）；乙腈（Fisher Scientific，質(zhì)譜純）；甲醇（Fisher Scientific，質(zhì)譜純）；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮮馬奶樣品的處理

為了消除高峰度蛋白對(duì)低峰度蛋白的影響首先用Proteominer試劑盒處理馬奶樣品，具體操作過程如下：離心柱子，避免有柱料沾在頂蓋上，摘除頂蓋和底蓋；1 000 g離心30～60 s，除去柱子中的儲(chǔ)液，棄收集管中的廢液；裝上底蓋，加入200μL wash buffer，并蓋上頂蓋；

在震蕩器上震5 min，使柱料充分與wash buffer混勻，并充分洗脫；去底蓋，柱子放入收集管中1 000 g離心30～60 s，棄廢液；重復(fù)3-4步；去頂蓋和底蓋，柱子放入收集管中，1 000 g離心30～60 s，棄廢液；蓋上底蓋，此時(shí)20μL的柱料已經(jīng)活化；樣品需要沒有沉淀，如果有需10 000 g離心10 min去沉淀；加上10μL樣品，加上頂蓋，在震蕩器上室溫震蕩2 h；去底蓋，1 000 g離心30～60 s，棄廢液；加底蓋，加入400μL wash buffer，加上頂蓋，震5 min；去底蓋 1 000 g離心30～60 s，棄廢液；重復(fù)12-13兩次；加入400μL雙蒸水；加蓋，震 1 min；去頂蓋和底蓋，1 000 g離心30～60 s，棄廢液；上底，加入40μL Elution Buffer；上蓋，漩渦震蕩15 min；去頂蓋和底蓋，1 000 g離心1 min。去離心下來的洗脫液進(jìn)行電泳[9-10]。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

將潔凈、無水的玻片對(duì)齊，形成空腔，插入塑料筐的凹槽中，確保下端平齊。放于制膠架上夾緊放平，下端緊貼密封條。配制12%濃度分離膠與4%濃縮膠，蛋白質(zhì)樣品，加入緩沖液（350 mmol/L Tris-Cl，p H 6.8），質(zhì)量濃度10%SDS，體積分?jǐn)?shù)36%甘油，5%β-巰基乙醇，質(zhì)量濃度0.012%溴酚蘭，95℃加熱5 min，使蛋白變性后上樣。80 V，30 min；再調(diào)到120 V，直至溴酚蘭到達(dá)分離膠最下沿，將電泳槽取出，兩塊板拿下來，用刮片從長(zhǎng)短玻片中間翹起，再把濃縮膠刮掉，取下，放于加有R 250染色液的染色皿中，染液浸過膠即可，置于在搖床上，轉(zhuǎn)速約為45 r/min，時(shí)間約1.0 h，完成后將染液倒掉，用水洗染液。取出染色過的膠放于置脫色液的缸里，脫色液浸過膠即可。置于在搖床上，轉(zhuǎn)速約為45 r/min，時(shí)間約1.0 h，本地色脫凈，條帶清晰可見即可。將脫色后的膠置于透明文件夾中，把膠上面的氣泡趕出，放到掃描儀上拍照[11-13]。處理前后SDS-PAGE電泳圖見1、2。

1.2.3 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解

將所選擇的膠點(diǎn)用1.5 mm切膠筆切下，置于eppendorf（EP）管，并記錄點(diǎn)號(hào)及相應(yīng)的位置；加50μL雙蒸水，洗兩次，10 min/次；加50 mmol/L NH4HCO3/乙腈=1∶1溶液50μL，超聲脫色5 min或37℃脫色20 min，吸干；重復(fù)步驟（3），直至藍(lán)色褪去；加乙腈50μL脫水至膠粒完全變白，真空抽干5 min；加10 mmol二硫蘇糖醇 DTT（10μL 1 mol/L DTT，990μL 25 mmol/L NH4HCO3配制）20μL，56℃水浴1 h；冷卻到室溫后，吸干，快速加55 mmol/L碘代乙酰胺IAM（55μL 1 mol/L IAM，945μL 25 mmol/L，NH4HCO3配制）20μL，置于暗室45 min；（10.2 mg/mL；依次25 mmol/L NH4HCO3、50%乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脫水到膠粒完全變白為止，真空抽干5 min；將0.1μg/μL的trypsin酶儲(chǔ)液以25 mmol/L NH4HCO3稀釋10倍，每EP管加2μL，稍微離心一下，讓酶液充分與膠粒接觸，4℃或冰上放置30 min，待溶液被膠塊完全吸收，加 25 mmol/L NH4HCO310～15μL置37℃，消化過夜；加入2%TFA（三氟乙酸）終止反應(yīng)，使TFA終濃度為0.1%，振蕩混勻，離心[14-15]。

1.2.4 質(zhì)譜檢測(cè)

1.2.4.1 檢測(cè)條件

LC色譜條件：色譜柱為C18柱（規(guī)格100mm×75 mm、孔徑300 A、粒徑5μm）；流速400 nL/min；洗脫液A為水和0.1%FA；洗脫液B為乙腈和0.1%FA，梯度洗脫：即A液95%，B液5%10min；A液70%，B液30%410min；A液40%，B液60%45min；A液20%，B液80%48min；A液20%，B液80%55min；A液95%，B液5%58 min；A液95%，B液5%65 min；A液100%，B液0%65.01 min。

QE質(zhì)譜檢測(cè)主要參數(shù)：離子模式：正離子模式；一級(jí)掃描范圍：350～2 000 u；二級(jí)掃描范圍：依賴于一級(jí)母離子質(zhì)合比自動(dòng)選擇；二級(jí)分辨率：17 500；毛細(xì)管溫度：320℃；離子源電壓：1 800 V；碎裂模式：HCD

按照上述條件對(duì)消化蛋白樣品進(jìn)行QE-LC-MS分析。

1.2.4.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

將質(zhì)譜信號(hào)圖轉(zhuǎn)換為mgf文件，將質(zhì)譜圖輸入到PD（Proteome Discoverer 1.3，thermo）軟件后，軟件先對(duì)質(zhì)譜譜圖進(jìn)行篩選。質(zhì)譜圖篩選參數(shù)為：母離子質(zhì)量范圍：350～6 000 u；二級(jí)質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)為10；值噪比S/N為1.5；PD提取后的譜圖用mascot進(jìn)行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。檢索參數(shù)如下：Mascot版本號(hào)：2.3.01；固定修飾（Fixed modification）：還原烷基化處理后，半胱氨酸產(chǎn)生的脲甲基化（Carbamidomethyl）；可變修飾（Variable modification）；蛋氨酸的氧化（Oxidation，M）和肽段N端存在谷氨酰胺時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生自身環(huán)化，變成谷氨酸（Gln→Pyro-Glu，N-term Q）；一級(jí)質(zhì)譜的精度（peptide tol）15ppm；二級(jí)質(zhì)譜的精度（MS/MS tol）：20mmu；酶解時(shí)最大允許漏切的數(shù)目（Max missed cleavages）：1；酶種類（Enzyme）：胰蛋白酶（Trypsin）；檢索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)（Database）：Uniprot2014_human

1.2.5 基因本體論對(duì)蛋白進(jìn)行歸類（Gene Ontology，簡(jiǎn)稱GO）

通過GO法對(duì)以檢測(cè)蛋白質(zhì)分別以其分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）、細(xì)胞組成（cell component）三種方式進(jìn)行歸類，揭示鮮馬奶生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE電泳

樣品通過Proteominer試劑盒處理前后電泳結(jié)果圖及切去蛋白條結(jié)果示意圖。

圖1 目標(biāo)蛋白的切膠示意圖

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

切取15蛋白條分別消化后質(zhì)譜檢測(cè)并檢索，將質(zhì)譜圖輸入到PD（Proteome Discoverer 1.3，thermo）軟件后，共查到283種蛋白質(zhì)，其中有200種蛋白為未命名，其余83種蛋白分析結(jié)果如下表1。

2.3 蛋白質(zhì)GO（Gene Ontology）分類結(jié)果

圖2 蛋白樣品處理前后電泳示意圖

本研究通過上述三種方法初步對(duì)鮮馬奶中283種蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類，首先從細(xì)胞定位信息進(jìn)行分析可知，蛋白質(zhì)基本分布在細(xì)胞質(zhì)（cytosol，GO：0005829）、外切 體 水泡（extracellular vesicular exosome，GO：0070062）、細(xì) 胞 外 區(qū) 域（extracellular space，GO：0005615）、細(xì)胞表面（perinuclear region of cytoplasm，GO：0048471）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，GO：0005783）、細(xì)胞核周圍區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm，GO：0048471）、高爾基體（Golgi apparatus，GO：0005794）、溶 酶 體 膜（lysosomal membrane，GO：0005765）等區(qū)域。

參與的生理過程有（biological process，BP）細(xì)胞增殖（cell proliferation，GO：0008283）、細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process，GO：0043066；positive regulation of apoptotic process，GO：0043065）、GTP酶 的 活 性（GTPase activity，GO：0003924）、乳糖合成酶活性（lactose synthase activity，GO：0004461）、細(xì)胞生長(zhǎng)的正負(fù)調(diào)控（positive regulation of cell growth，GO：0030307；negative regulation of cell growth，GO：0030308）、炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控（negative regulation of inflammatory response，GO：0050728）、細(xì)胞氧化-還原平衡（cell redox homeostasis，GO：0045454）、大腦發(fā)育（brain development，GO：0007420）、血管生成的負(fù)調(diào)控（negative regulation of angiogenesis，GO：0016525）、免疫反應(yīng)（immune response，GO：0006955）等。

分子功能（molecular function，MF）主要有金屬離子結(jié)合（metal ion binding，GO：0046872）、ATP結(jié)合（ATP binding，GO：0005524）、聚RNA結(jié)合（poly（A）RNA binding，GO：0044822）、谷胱甘肽過氧化物酶活性（glutathione peroxidase activity，GO：0004602）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity，GO：0016491）、肽酶 激 活 劑 活 性（peptidase activator activity，GO：0016504）、GTP酶 活 性（GTPase activity，GO：0003924）、乳糖合成酶活性（lactose synthase activity，GO：0004461）、清道夫受體活性（scavenger receptor activity，GO：0005044）等。結(jié)果如圖3-圖5。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)為構(gòu)成組織與修補(bǔ)組織的主要成分之一。它是構(gòu)成組織細(xì)胞的主要材料。人的大腦、神經(jīng)、皮膚、肌肉、內(nèi)臟、血液，甚至指甲、頭發(fā)都是以蛋白質(zhì)為主要成分構(gòu)成的。身體的發(fā)育成長(zhǎng)、成長(zhǎng)后衰老組織的更新、損傷后組織的新生修補(bǔ)，蛋白質(zhì)都是主要的成分。蛋白質(zhì)又是構(gòu)成酶和某些激素的成分。能增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，構(gòu)成抗體。機(jī)體抵抗力的強(qiáng)弱，決定于抵抗疾病的抗體多少。并且可以調(diào)節(jié)滲透壓，正常人血漿與組織液之間的水不停地交換，但卻保持著平衡。其所以能平衡，有賴于血漿中電解質(zhì)總量和膠體蛋白質(zhì)的濃度。在組織液與血漿的電解質(zhì)濃度相等時(shí)，兩者間水分的分布就取決于血漿中白蛋白的濃度。若膳食中長(zhǎng)期缺乏蛋白質(zhì)時(shí)，血漿蛋白的含量便降低，血液內(nèi)的水分便過多地滲入周圍組織，就造成營(yíng)養(yǎng)不良性水腫。其次供給熱能，雖然蛋白質(zhì)在體內(nèi)的主要功能并非供給熱能，但是陳舊的或已經(jīng)破損的組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，會(huì)不斷分解釋放能量。另外，每天從食物中攝入的蛋白質(zhì)中有些不符合人體需要，或者數(shù)量過多的，也將被氧化分解而釋放能量。所以蛋白質(zhì)也可以供給部分熱能。由此可見，在生命活動(dòng)過程中蛋白質(zhì)是無處不存在，而且具有多種生理功能，是人體所必需的重要營(yíng)養(yǎng)素之一[16-19]。

表1 鮮馬奶蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果

（續(xù)表1）

圖3 鮮馬奶蛋白質(zhì)“分子功能”分類結(jié)果

圖4 鮮馬奶蛋白質(zhì)“生物過程”分類結(jié)果

圖5 鮮馬奶蛋白質(zhì)“細(xì)胞組成”分類結(jié)果

蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明蛋白質(zhì)組學(xué)及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對(duì)正常個(gè)體及病理個(gè)體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，它們可成為新藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，或者也會(huì)為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。確實(shí)，那些世界范圍內(nèi)銷路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點(diǎn)為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進(jìn)入后基因時(shí)代的特征[20-25]。

本研究通過SDS-PAGE電泳對(duì)鮮馬奶中蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，選擇15個(gè)膠條進(jìn)行切割、消化后，通過QE-LC-MS質(zhì)譜進(jìn)行分析，并與蛋白圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，檢索出283種蛋白質(zhì)，并通過GO法對(duì)以檢測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類，揭示鮮馬奶生物學(xué)功能。因此本研究分別通過上述三種分類方法對(duì)鮮馬奶中283種蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鮮馬奶中蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞內(nèi)外、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核、質(zhì)膜、線粒體等區(qū)域，參與細(xì)胞增殖正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)正調(diào)控、血管生成正負(fù)調(diào)控。脂質(zhì)代謝、乳糖合成等生理過程，具有金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合、核酸結(jié)合、肽酶激活劑活性、清道夫受體活性、G-蛋白偶聯(lián)受體活性等活性。

總之，鮮馬奶中有機(jī)體正常生理過程所需的各類蛋白，參與機(jī)體的生理過程，起到關(guān)鍵作用，為今后鮮馬奶的功能研究及定位提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。