趙存朝，王雪峰，黃夢，魏光強(qiáng)，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

0 引 言

貫筋藤（Dregea sinensis hemsl）為蘿藦科、南山藤屬植物，攀援木質(zhì)藤本，俗稱“奶漿藤”[1]。生長于海拔500～3000米山地森林中或灌木叢中，在中國滇西北地區(qū)，長期以來用貫筋藤莖桿的熱水溶液加工乳餅，而不是常規(guī)的酸水做凝乳劑[2]。作者所在課題組通過國家基金項(xiàng)目-貫筋藤凝乳機(jī)理的研究（31160331）結(jié)果表明，貫筋藤蛋白酶對(duì)CN，α、β、κ-CN均有降解作用，α-CN部分降解，β-CN和κ-CN全部降解，是一種復(fù)合蛋白酶，主要是分子量23.8 ku的半胱氨酸蛋白酶procerain B，該酶具有耐高溫、耐酸堿性能較好、凝乳活力較高等酶學(xué)特性[3-5]；通過MALDI-TOF質(zhì)譜儀測定酶切肽段的分子量、蛋白多肽序列測序儀測定氨基酸序列，確定κ-CN的酶切位點(diǎn)為Ala90-Glu91，產(chǎn)生分子量分別12 ku的副κ-酪蛋白和6.9 ku的CGMP；且不同于大多數(shù)凝乳酶的酶切位點(diǎn)Phe105-Met106[6]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

山羊乳，貫筋藤凝乳酶（由實(shí)驗(yàn)室提供[3-6]）酶活力為223.135 SU/mL。牛血清蛋白，唾液酸；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

URA14M 0018分光光度計(jì)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TGL20M高速冷凍離心機(jī)，HWS24型水浴鍋，DYY-6C電泳儀，Bro-rid伯樂垂直電泳槽。

1.3 方法

1.3.1 山羊乳CGMP粗提工藝流程

山羊乳脫脂（3 040 g、離心10 min）→酶解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（3 040 g離心20 min）→20%的硫酸銨鹽析→離心（10 000 g離心10 min）→ 透析脫鹽（分子量為500～1 000 u的透析袋）→ 冷凍干燥（5～10 MPa，-50℃）→CGMP粗品。

1.3.2 酶解制備CGMP單因素工藝篩選

那天午后，知了在樹上嘰嘰喳喳地叫著，我對(duì)著天空，呆呆地望著它，媽媽見我這樣，急忙想出一個(gè)好點(diǎn)子，我們?nèi)D書館吧！我像一只被放出籠子的小鳥一樣，沖到了圖書館。

以貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳后酶解液的水解度和CGMP含量為指標(biāo)?？疾烀附鈺r(shí)間（20，30，40，50，60 min），酶解溫度（70，75，80，85，90℃），酶的添加量（以脫脂山羊乳體積的4%，5%，6%，7%，8%，9%）對(duì)山羊乳酶解液水解度和CGMP質(zhì)量濃度的影響，確定貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳的最佳因素水平。

1.3.3 山羊乳源CGMP提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取酶解時(shí)間、酶解溫度、酶的添加量3個(gè)因素，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化貫筋藤蛋白酶提取山羊乳源酪蛋白糖巨肽的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

式中：h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量（mmol/L）；htot為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量（mmol/L），乳酪蛋白濃度為htot=8.2 mmol/L；B為水解過程中的耗堿量(mL)；Nb為堿液濃度（mol/L）；MP為水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；a為校正系數(shù)（設(shè)貫筋藤蛋白酶=1）。

（2）CGMP質(zhì)量濃度測定[10]。κ-酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質(zhì)，而唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸）都集中在CGMP上，所以可以用測定唾液酸含量的大小鑒定CGMP生成量的多少。配制3.26 mmol/L的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加入間苯二酚試劑工作液2 mL（2%的間苯二酚溶液10 mL，加入濃度為0.1 mol/L的硫酸銅溶液0.25 mL，加入濃鹽酸80 mL，用蒸餾水定容至100 mL，

1.3.4 山羊乳酶解液中CGMP的檢測

（1）水解度測定[15]。水解度的測定采用p H-stat法，水解度的計(jì)算公式為置于室溫4 h后4℃儲(chǔ)存）至具塞試管中，加蓋置于沸水浴中加熱15 min，然后快速冷卻，加有機(jī)溶液乙酸丁酯-正丁醇（85：15）4 mL，振蕩提取后在37℃下水浴5 min，4℃(2 860 g)轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層有機(jī)相，于波長580 nm處測定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=1.4141x+0.0409（0.1008～0.6048 mg/mL，R2=0.999；y為吸光度，x為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度。取樣品溶液2 mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定水解液吸光值。

式中：A580為水解液吸光度；V1為水解液體積；V2為山羊奶體積。

（3）CGMP純度測定[16]。采用紫外吸收法測酪蛋白糖巨肽的濃度。CGMP的化學(xué)特征為不含芳香族氨基酸，只有205 nm～217 nm處的紫外吸收，在280 nm處沒有紫外吸收。因此，210 nm與280 nm處的紫外吸收差值可用于CGMP純度的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)測定山羊乳酶解液超濾后不同分子量的CGMP粗品的純度。

式中：OD210-210 nm吸光度；OD280-280 nm吸光度。

（4）蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)比色法[17]。

（5）CGMP的糖基化度[18]。CGMP的功能性成分是唾液酸，CGMP片段中唾液酸含量與蛋白質(zhì)含量的比值越大，則糖基化度越大。糖基化度為間苯二酚-鹽酸法測定唾液酸在580 nm處的吸光度與水解液中蛋白含量的比值。

1.3.5 理化指標(biāo)測定

（1）水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定根據(jù)GB 5009.3-2016中的直接干燥法進(jìn)行；（2）脂肪分?jǐn)?shù)測定根據(jù)GB 5413.3-2010中的相關(guān)方法進(jìn)行；（3）蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定根據(jù)GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法，對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定；（4）灰分測定根據(jù)GB 5009.4-2016中的相關(guān)方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析、利用spss24對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解制備CGMP單因素實(shí)驗(yàn)

以貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳溫度（70，75，80，85，90℃），時(shí)間（20，30，40，50，60 min），酶的添加量（4%，5%，6%，7%，8%，9%）為考察因素，對(duì)脫脂后的山羊乳進(jìn)行酶解，4 000 g離心20 min；離心后取上清液，測定其水解度及唾液酸質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解因素對(duì)水解度及唾液酸質(zhì)量濃度的影響

圖1 中，所有的值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD；n=3）；CGMP質(zhì)量濃度及水解度曲線上具有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。

由圖1可以看出，山羊乳酶解液水解度及唾液酸質(zhì)量濃芳隨著酶解溫度的提高呈先上升后下降趨勢；酶解液水解度及唾液酸質(zhì)量濃度85℃是顯著高于其他酶解溫度，分別為19.68%和2.846 mg/mL（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的提高，山羊乳的凝乳時(shí)間在縮短，且85℃時(shí)山羊乳5 min內(nèi)凝乳，凝乳時(shí)間較短；原因可能是：凝乳發(fā)生時(shí)總的κ-酪蛋白被水解掉約80%后，在鈣離子與酪蛋白膠粒間形成化學(xué)鍵形成凝塊或凝固的乳，使部分CGMP不能測定出來，造成CGMP含量及水解度下降[19]。

隨著時(shí)間增加山羊乳酶解液唾液酸含量呈上升后下降的趨勢；酶解液唾液酸含量在酶解30 min時(shí)顯著高于其他酶解時(shí)間，2.661 mg/mL（P＜0.05）；隨著時(shí)間的延長，水解度隨時(shí)間增加呈上升趨勢。原因可能是：隨時(shí)間延長導(dǎo)致除CGMP外的非目標(biāo)肽增加，水解度不斷提高，但30 min時(shí)酶解液中CGMP含量最高，故選擇30 min為最佳酶解時(shí)間。

隨著酶添加量的增加，山羊乳酶解液水解度及其中唾液酸含量呈上升趨勢；當(dāng)酶的添加量超過7%時(shí)水解度趨近于平緩，差異不顯著，酶的添加量超過6%時(shí)CGMP含量趨近于平緩，差異不顯著（P＜0.05）；酶的添加量達(dá)到7%時(shí)，山羊乳酶解液水解度及CGMP含量最大，故選取7%為酶解最適添加量。原因可能是：隨著酶的添加量提高，酪蛋白膠粒表面的κ-酪蛋白分子層部分分解，內(nèi)部的α，β-酪蛋白失去膠體保護(hù)作用也會(huì)被貫筋藤凝乳酶水解，所以山羊乳酶解液水解度會(huì)隨之提高，所以內(nèi)層酪蛋白在很短時(shí)間內(nèi)會(huì)和貫筋藤蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，自然會(huì)引入非目標(biāo)肽類，所以本實(shí)驗(yàn)不能使酶解反應(yīng)無限制的進(jìn)行[20]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過擬合二次方程計(jì)算最優(yōu)工藝組合以及山羊乳CGMP的最大理論提取量。選擇酶的添加量（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時(shí)間（X3）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到羊乳酶解液水解度、唾液酸含量與酶的添加量（X1）、溫度（X2）、時(shí)間（X3）的二次方程模型為：Y1=18.87+1.21X1+0.62X2+0.75X3+0.6X1X2－0.17X1X3－0.53X2X3－1.78X12－1.71X22+0.11X32；Y2=3+0.13X1－ 0.074X2+0.014X3+0.028X1X2－（3.75×10-3）X1X3－0.14X2X3－0.45X12－0.42X22－0.53X32。回歸模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

由表3方差分析可知：山羊乳乳清水解度回歸模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.0001＜0.05，乳清中唾液酸質(zhì)量濃度回歸模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.0001＜0.05，說明兩者二次多元回歸模型極顯著；山羊乳乳清水解度回歸模型失擬性檢驗(yàn)P=0.7716＞0.05，唾液酸質(zhì)量濃度回歸模型失擬性檢驗(yàn)P=0.1027＞0.05，可以認(rèn)為所選水解度及CGMP質(zhì)量濃度二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。水解度回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=0.9746，信噪比Adeq precisior=14.764，唾液酸質(zhì)量濃度回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=0.9865，信噪比Adeq precisior=18.532。這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于預(yù)測山羊乳乳清的水解度及唾液酸的提取質(zhì)量濃度。離散系數(shù)C.V（Y的變異系數(shù)）表示實(shí)驗(yàn)本身的精確度，C.V值越小，實(shí)驗(yàn)的可靠性越高，水解度擬合C.V值為2.47%，唾液酸質(zhì)量濃度過C.V值為3.45%。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測山羊乳酶解液的水解度及唾液酸的提取量，說明實(shí)驗(yàn)操作可信度高，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。由回歸系數(shù)顯著性表明，在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)山羊乳水解度影響的順序?yàn)椋好傅奶砑恿浚久附鈺r(shí)間＞酶解溫度；各因素對(duì)山羊乳乳清唾液酸含量影響的順序?yàn)椋好傅奶砑恿浚久附鉁囟龋久附鈺r(shí)間。

表3 水解度及唾液酸含量回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

圖2和是通過二次回歸模型擬合的響應(yīng)面變化三維曲面。響應(yīng)面和等高線的稀疏程度可直觀地反映溫度℃、時(shí)間min、酶的添加量%之間交互作用對(duì)山羊乳蛋白水解度%及其中唾液酸質(zhì)量濃度的影響，當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著。

由圖2可以看出：隨著時(shí)間的延長山羊乳水解度呈上升趨勢，而溫度的不斷上升使山羊乳水解度呈先上升后下降趨勢，與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表4方差分析顯示，貫筋藤酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用顯著，P=0.0252＜0.05；隨著貫筋藤蛋白酶添加量與溫度的提高，山羊乳水解度呈先上升后下降的趨勢，表4方差分析顯示，貫筋藤蛋白酶的添加量與溫度交互作用顯著，P=0.042＜0.05；固定酶的添加量為0水平，隨著時(shí)間及酶解溫度的提高山羊乳酶解液中CGMP質(zhì)量濃度呈先上升后下降的趨勢，表3方差分析顯示，酶解時(shí)間與溫度交互作用顯著，P=0.0107＜0.05；二次回歸模型擬合結(jié)果顯示，酶的添加量7.24%，時(shí)間達(dá)31.76 min，酶解溫度為85.21℃時(shí)，山羊乳清水解度及唾液酸含量響應(yīng)曲面出現(xiàn)最高點(diǎn)，水解度預(yù)測值19.21%，唾液酸質(zhì)量濃度預(yù)測值2.991 mg/mL。

圖2 各因素交互作用對(duì)山羊乳水解度及唾液酸質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

回歸模型通過響應(yīng)面法得到最優(yōu)山羊乳清水解度及唾液酸含量的工藝條件，為驗(yàn)證該模型的預(yù)測是否準(zhǔn)確，考慮實(shí)際操作情況的方便性與設(shè)備參數(shù)狀況，確定貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳最佳工藝條件為：酶的添加量7%，酶解溫度85℃，酶解時(shí)間32 min，在此條件下進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明水解度為21.19%±0.46%，CGMP質(zhì)量濃度為（2.821±0.0331）mg/mL，與預(yù)測值接近，說明模型準(zhǔn)確可靠。山羊乳在酶解過程中凝乳狀態(tài)良好，水解穩(wěn)定。

2.3 山羊乳源CGMP的檢測

配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的山羊乳CGMP凍干粉粗品，對(duì)其進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 山羊乳CGMP檢測

2.4 理化指標(biāo)測定

相關(guān)理化指標(biāo)結(jié)果如表5所示。

表5 山羊乳CGMP理化指標(biāo)測定 %

3 結(jié) 論

（1）實(shí)驗(yàn)以貫筋藤蛋白酶、山羊乳為材料，利用酶法對(duì)山羊乳源CGMP的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，重點(diǎn)分析酶解因素作用規(guī)律，通過響應(yīng)面試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了貫筋藤酶解山羊乳源CGMP的最佳提取工藝。

（2）利用貫筋藤酶解山羊乳制備的CGMP具有較高的糖基化度及純度，為提高山羊乳資源的綜合利用水平，生物活性制劑、保健食品、醫(yī)藥品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。