李艷 潘彤 李浩龍 孔偉偉 袁玉華

作者單位：300308 天津，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗科（李艷、袁玉華）

300052 天津，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科（孔偉偉）

300110 天津，天津市血液中心（潘彤、李浩龍）

目前在臨床上血液篩查人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）最常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。到目前為止，HIV-1的ELISA試劑已經(jīng)發(fā)展至第4代［1-4］。1983年美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準了第1個HIV抗體檢測試劑，即第1代HIV診斷試劑，用于獻血員的篩查，其原理為采用間接ELISA法，用純化裂解病毒的HIV抗原和部分純化的抗原檢測HIV免疫球蛋白G（IgG）抗體，這種病毒裂解物中不僅含有較多雜抗原，而且抗原的制備和純化都比較困難，假陽性率和假陰性率均較高，窗口期較長［5］?；蚬こ碳夹g的快速發(fā)展給HIV抗原的獲得提供了新的途徑，1990年5月HIV第2代診斷試劑面市，它通過間接ELISA法用基因工程重組或合成的HIV多肽抗原檢測HIV-1/2的IgG抗體，其制備安全、重復性好，與第1代試劑相比敏感度和特異度均有較大提高［6］。1994年，第3代試劑的反應模式由前兩代的間接法改為雙抗原夾心法檢測標本中的抗體，酶標記物由特異性HIV抗原代替抗人IgG，可檢測HIV不同的抗體亞型HIV-1/2/O的IgG/M/A，敏感度和特異度均高于第1代和第2代試劑，改善了O群標本的反應性，窗口期縮短至22 d［5］，也是目前國內外HIV檢測的主流方法。第4代試劑采用雙抗原或抗體夾心法，用重組或合成的HIV多肽抗原、P24單克隆抗體固相包被檢測HIV-1/2/O的IgG/M/A抗體、P24抗原，提高了血清陽轉前標本的檢出率［7］，且HIV-1早期篩查的效果優(yōu)于第3代試劑［8］。

ELISA法檢測HIV的敏感度較高，但檢測結果易出現(xiàn)假陽性，HIV抗體假陽性受檢者不僅要承受巨大的心理壓力，而且要承受不必要的治療，造成醫(yī)療資源浪費。對采血機構來說，假陽性結果還會造成大量血液的報廢和獻血員永久性丟失。

針對目前常規(guī)HIV-1的ELISA檢測試劑存在的上述問題，我們采用液相芯片法，對蛋白質免疫印跡試驗（Western Blot）確認陽性及陰性樣本進行HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測抗體分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Luminex-200（美國Luminex公司）；電動渦旋器VSM-3（美國PRO Scientific Inc.）；超聲儀KQ-700DV型（昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機（德國Heraus公司）；空氣浴振蕩器（HZQ-C哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（日本Millipore公司）；Eppendorf微量加樣器（美國Eppendorf公司）。HIV-1 gp120、gp41、p24抗原（北京萬泰公司）；Luminex微球（50#、56#、71#），抗體偶聯(lián)試劑盒（美國Luminex公司）；ELISA初檢試劑（HIV抗原抗體診斷試劑盒，北京萬泰公司、北京金豪公司），復檢試劑（HIV抗原抗體診斷試劑盒，法國生物梅里埃、法國Bio-Rad）；生物素化二抗（美國BD公司）；SA-PE（美國Ivitrogen公司）；96孔板（美國康寧公司）；錫箔紙，普通生化試劑（天津聯(lián)星生物技術有限公司）。受檢標本：均來自天津市血液中心。

1.2 檢測方法

1.2.1 微球的包被 HIV-1的gp120、gp41、p24蛋白和微球的偶聯(lián)方法按照美國Luminex公司操作手冊進行操作。

1.2.2 液相芯片法檢測 采用液相芯片法對經(jīng)ELISA法初檢和復檢為HIV-1陽性而Western Blot檢測HIV-1確認試驗為陰性的樣本進行檢測：① 加樣前用100 μL/孔的分析緩沖液潤濕96孔板；② 加入陰性血清和用分析緩沖液稀釋25倍的陽性血清（25 μL/孔）；③ 加入混勻稀釋好的微球（確保 100個 /μL，25 μL/孔）；④ 室溫震蕩培養(yǎng)1 h；⑤ 室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；⑥ 125 μL/孔洗滌緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；⑦ 重復第6步2次；⑧ 加入稀釋好的生物素化二抗（2 mg/L，25 μL/孔）；⑨ 室溫震蕩培養(yǎng)1 h；⑩ 室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；125 μL/孔緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；每孔加入20 mg/L SA-PE 25 μL；室溫震蕩孵育30 min；室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；125 μL/孔洗滌緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；加入125 μL/孔洗滌緩沖液重懸微球，采用Luminex-200檢測，Luminex-100軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 本研究繪制受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC），評估ELISA法和液相芯片法對HIV-1抗體的檢測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3種微球截斷值 用液相芯片法測定3種微球的cut-off值，即HIV陰性標本的平均熒光強度（mean fluoresence intensity，MFI）+2× 標準差（SD），見表 1。

表1 76份HIV ELISA陰性標本不同免疫微球的截斷值

2.2 HIV-1的 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測不同樣本結果 應用液相芯片法對Western Blot確認HIV陽性及陰性樣本進行HIV-1 gp120、gp41、p24抗體的分析。結果顯示，根據(jù)《艾滋病檢測技術規(guī)范》判定標準，55份Western Blot檢測確認HIV-1陽性樣本，液相芯片法檢測全部為陽性，符合率100%；76份ELISA初檢和復檢陰性標本HIV-1 gp120、gp41、p24片段檢測均為陰性；86份ELISA檢測初檢和復檢為陽性，而Western Blot檢測確認陰性樣本，其HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測均陰性。見表2。

表2 液相芯片法檢測標本HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原結果

2.3 ROC曲線分析 液相芯片法檢測HIV-1抗體的敏感度（100%）和特異度（100%）均較ELISA法檢測HIV-1抗體好，兩種方法檢測HIV-1抗體比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩種方法檢測HIV-1抗體的ROC曲線

3 討論

ELISA法檢測HIV抗體造成假陽性的原因是多方面的，如試劑質量（試劑材料的純度、檢測體系的優(yōu)化）、樣本（某些自身免疫性疾病造成的血漿蛋白出現(xiàn)異常）等，都會影響試劑的特異性。

被譽為“后基因組時代芯片技術”的液相芯片技術于20世紀90年代中期開始發(fā)展，又稱為懸浮芯片技術、多功能懸浮點陣技術、Luminex技術或xMAP技術。液相芯片技術最突出的優(yōu)點為僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測。同時液相芯片技術具有很高的敏感度和特異度，載體微球表面積大，每個微球上可包被10萬個捕獲抗體或抗原，如此高密度的捕獲抗體或抗原保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原或抗體分子結合，提高了檢測的敏感度，最低檢測濃度可達到0.1 ng/L。每種微球檢測100個，將最終讀取熒光強度的中值作為結果，這相當于對每個樣本重復檢測100次，而ELISA法僅為雙復孔或三復孔，因此液相芯片法檢測結果的準確性和重復性是ELISA法無法比擬的。同時液相芯片法的敏感度也遠高于任何現(xiàn)有的分析和診斷方法以及其他芯片法，已廣泛應用于國內外科研和臨床檢測［9-10］。

采用液相芯片法對組成HIV-1 ELISA試劑的主要包被抗原HIV-1 gp120、gp41、p24單片段分別進行檢測，Western Blot法確認陽性樣本檢測符合率為100%；對ELISA法初檢和復檢陰性標本檢測符合率也為100%；對ELISA法檢測初檢和復檢陽性、Western Blot檢測確認陰性樣本的陰性符合率為100%。說明液相芯片法檢測HIV-1的敏感度和特異度均明顯高于ELISA檢測試劑。

影響試劑敏感度和特異度的因素很復雜，除了HIV-1 gp120、gp41兩個片段，還有HIV-2 gp36（第3代試劑）和P24單克隆抗體（第4代試劑）組成的ELISA試劑，已有研究顯示HIV-1 ELISA試劑因多個抗原甚至抗體共同包被于微孔板，可能會造成免疫反應的空間位阻，影響檢測的敏感度和特異度，而采用液相芯片法則可避免此效應［11］，液相芯片法和Western Blot法聯(lián)合檢測可以提高HIV抗體檢測的敏感度［12］。設想采用液相芯片技術組成的HIV-1抗體檢測系統(tǒng)（如在本檢測系統(tǒng)應用前加上HIV-2抗原片段）將成為新一代檢測試劑，發(fā)展前景良好。