歐明娥，唐鐵鑫，吳偉斌

(肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東 肇慶 526020)

肺炎(pneumonia)是兒科四大疾病(肺炎、腹瀉 、維生素D缺乏性佝僂病、營養(yǎng)性貧血)防治之首，占5歲以下死亡率的15%，全球2013年死亡人數(shù)將近100萬[1]，是5歲以下兒童死亡的主要原因之一；也是兒童轉(zhuǎn)診和入院的主要原因，且發(fā)展中國家死亡率明顯高于發(fā)達(dá)國家[2]。因此如何積極有效地防治本病已成為中西醫(yī)研究的一個重要課題。本研究擬用脂多糖(lipopolysaecharide，LPS)誘發(fā)急性肺損傷模型，觀察廣佛手水提取物和醇提取物對體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549釋放白細(xì)胞介素8(interleukin，IL-8)和白細(xì)胞介素10(interleukin，IL-10)的影響，旨在為中藥廣佛手在兒童肺炎防治中的作用提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.2 試驗(yàn)藥物

廣佛手水提取物和醇提取物自行制備。取佛手藥材，粉碎，過40目篩。取粗粉50 g，加水，用揮發(fā)油提取器提?。惶崛∑鲀?nèi)容物濾過，藥渣再加8倍水煎煮提取1次，合并2次提取液，取10 mL提取液，置蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸干得到干固物，粉碎作為水提浸膏粉。取粗粉5 g，加乙醇50 mL，水浴回流提取1 h，過濾，濾液蒸干，干固物粉碎得到醇提浸膏粉。將水提取物和醇提取物溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，均制成2 mg/mL備用。

1.3 主要儀器與試劑

儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱(160i，美國熱電);臺式超速冷凍離心機(jī)(ST-16R，美國熱電);超凈工作臺(BCM-1300A，蘇州安泰);十萬分之一精密分析天平(MS205DU，梅特勒);液氮生物容器(BioCane 47，美國熱電);超純水儀(Milli-Q Direct-8，美國 MilliQ公司);酶標(biāo)儀(Multiskan FC，美國熱電)。主要試劑及藥品:RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所);胰蛋白酶(美國Gibco公司);CCK8(美國MCE公司);脂多糖(LPS)(美國Sigma公司);IL-8和IL-10檢測試劑盒(深圳市達(dá)科為生物工程有限公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將含有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549的凍存管從液氮中小心取出，立即輕輕投入預(yù)先準(zhǔn)備好的37℃水中，遠(yuǎn)離面部，輕輕順時針搖動使冷凍管內(nèi)容物盡快融化，直到凍存管中剩少許冰晶，將凍存管從37℃水浴中取出，用乙醇擦拭消毒凍存管，加入RMPI-1640完全培養(yǎng)液(含10%FCS，pH7.2)稀釋后置于離心機(jī)，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，混懸細(xì)胞，按1傳1的比例接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待長到80%時以0.25%胰蛋白酶消化，加入0.45 mL/瓶胰蛋白酶，37℃ 3 min，用0.1 mL移液器輕輕吹打，加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化，用1 mL移液器反復(fù)輕柔吹打后，1 000 r/min離心5 min，去上清液，計(jì)數(shù)后用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK8法檢測廣佛手提取物對A549細(xì)胞活力的影響

A549細(xì)胞用完全培養(yǎng)液制成4×104/mL細(xì)胞懸液，100 μL/孔接種于96孔板，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白對照組和藥物處理組，藥物處理組加水提取物(終濃度分別為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)，醇提取物(終濃度分別為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)，空白對照組加等量無血清培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后在每孔中加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液。將酶標(biāo)儀測定波長調(diào)為450 nm，檢測96孔板各孔吸光度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力(%)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。公式為：細(xì)胞活力(%)=藥物處理組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.6 廣佛手水提取物和醇提取物對A549細(xì)胞釋放IL-8的影響

A549細(xì)胞用完全培養(yǎng)液制成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種于12孔板中，置于37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合后，用于以下實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為空白對照組、LPS組、水提取物(0.25、0.5、1 mg/mL)組、醇提取物(0.25、0.5、1 mg/mL)組，除空白對照組外，各組加入不同濃度廣佛手提取物和LPS(10 μg/mL)，空白對照組加入等量無血清培養(yǎng)基。置37℃5%CO2中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測。取培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心20 min后，以酶聯(lián)免疫法(ELISA)法測定IL-8和IL-10含量。按照試劑盒說明進(jìn)行步驟。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時用秩和檢驗(yàn)。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度廣佛手提取物對A549細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，廣佛手水提取物和醇提取物濃度為31.25～2 000 μg/mL時，與空白組比較，對細(xì)胞活力的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 廣佛手提取物對A549細(xì)胞活力的影響

2.2 廣佛手水提取物和醇提取物對脂多糖誘導(dǎo)的A549細(xì)胞分泌IL-8的影響

LPS刺激A549細(xì)胞24 h后，上清液中IL-8和IL-10含量均升高(P<0.01)，廣佛手水提取物三個劑量和醇提取物三個劑量對LPS誘導(dǎo)的IL-8分泌增加呈顯著抑制作用(P<0.01)，并存在著一定的量效關(guān)系。廣佛手水提取物三個劑量在LPS誘導(dǎo)后IL-10分泌明顯增加(P<0.01)，而廣佛手醇提取物三個劑量對LPS誘導(dǎo)的IL-10分泌增加僅呈抑制作用(P<0.01)。同等劑量水提取物和醇提取物對LPS誘導(dǎo)的IL-8分泌增的抑制作用無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組上清液IL-8和IL-10水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

3 討論

肺炎的病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放導(dǎo)致促炎-抗炎反應(yīng)失衡在其中起的重要作用受到了高度關(guān)注。一旦促炎和抑炎平衡被打破，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至發(fā)生多臟器衰竭。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，又稱內(nèi)毒素，是強(qiáng)烈的炎癥啟動因子。LPS是導(dǎo)致包括急性肺損傷(acute lung injury，ALI)在內(nèi)的嚴(yán)重炎性疾病的主要感染性刺激[3],大量文獻(xiàn)報(bào)道LPS被廣泛應(yīng)用于小鼠ALI模型的制造[4-6]。肺泡上皮細(xì)胞不僅是各種損傷因素作用的靶細(xì)胞，更是炎性反應(yīng)的積極參與者，能被LPS激活，釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙和凋亡、壞死等改變，對ALI的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。

IL-8是一種促炎細(xì)胞因子，可趨化中性粒細(xì)胞滲出到炎癥部位,參與趨化、激活中性粒細(xì)胞的全過程。ALL患者中肺泡灌洗液及肺組織中IL-8含量明顯增高[7-8]。且IL-8的高血清水平與疾病的嚴(yán)重程度和死亡率相關(guān)[9]。IL-10是一種多效細(xì)胞免疫因子，IL-10的不同生物學(xué)作用依賴于不同的微環(huán)境和病理?xiàng)l件。在感染疾病模型中IL-10發(fā)揮經(jīng)典的免疫抑制作用[10]，具有縮短炎癥持續(xù)時間或減輕其嚴(yán)重程度，對其他細(xì)胞因子形成的網(wǎng)絡(luò)具有調(diào)節(jié)作用，具有非常強(qiáng)的免疫抑制作用及抗炎作用。IL-10在呼吸道合胞病毒感染中起到重要的抗炎作用，IL-10不僅能阻止急性炎癥，而且可以阻止合胞病毒促發(fā)Th1/Th2反應(yīng)[11]。在細(xì)菌感染過程中，IL-10亦可以調(diào)節(jié)包括肺在內(nèi)的多種器官的細(xì)菌感染過程的炎癥免疫反應(yīng)，是指導(dǎo)不同細(xì)菌感染過程中免疫應(yīng)答的最重要細(xì)胞因子之一[12]。IL-8、IL-10均參與到肺炎支原體肺炎的發(fā)病中，IL-8是發(fā)生肺炎支原體肺炎后導(dǎo)致肺部纖維化形成的重要因素，檢測IL-10能夠了解肺炎支原體肺炎的嚴(yán)重程度[13]。

佛手又名佛手柑、佛手香櫞、蜜羅柑等。因產(chǎn)地不同有廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手之分。主產(chǎn)于廣東肇慶等地的稱“廣佛手”。佛手性溫味辛、苦、酸，具有疏肝理氣，破積消癥；和胃止嘔，消食解酒；豁痰導(dǎo)滯，燥濕止咳等功效。現(xiàn)代研究表明佛手主要含有揮發(fā)油、多糖、黃酮等成分，有研究顯示佛手醇提取液有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用[14-15]。

本文結(jié)果表明，廣佛手水提取物和醇提取物各濃度對肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞活力無顯著影響。LPS可使A549釋放IL-8和IL-10增加，提示LPS作用于A549后，A549產(chǎn)生反應(yīng)性變化，炎癥因子IL-8和抗炎因子IL-10分泌釋放均增加。廣佛手水提取物和醇提取物可減少LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的炎癥因子IL-8釋放，提示廣佛手對LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞IL-8的釋放有抑制作用，可減輕肺組織炎癥程度，且與濃度呈一定的量效關(guān)系。且廣佛手水提取物與醇提取物對A549細(xì)胞IL-8的釋放的抑制作用無明顯差異。在抗炎因子IL-10的釋放中，廣佛手水提取物可明顯增加LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的IL-10釋放，而醇提取則減少LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的IL-10釋放增加，提示廣佛手水提取物對LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)有抑制作用，廣佛手水提取物與醇提取物在IL-10的釋放中的作用不同，這可能源于兩種提取方法所得到的成分不同，亦可能與IL-10具有免疫抑制和免疫刺激雙向免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。廣佛手中何種有效成分通過何種機(jī)制發(fā)揮抗炎免疫作用，需要我們進(jìn)一步探索。